Главная стр 1
скачать


БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Выпускная работа по


«Основам информационных технологий
»
3ФР84

Магистрант

физического факультета

кафедры биофизики

Голубева Елена Николаевна

Руководители:

доцент кафедры биофизики

канд. биол. наук

Мартинович Григорий Григорьевич,

старший преподаватель


Кожич Павел Павлович

Минск – 2010 г.


Оглавление


Оглавление 2

Список обозначений ко всей выпускной работе 4

Реферат на тему «Перспективы использования ИТ в биофизических исследованиях» 5

Введение 5

Глава 1 Обзор литературы 6

1.1 Информационные технологии в научных исследованиях 6

1.2 Среда MatLab 8

1.2.1 Описание языка 9

1.2.2 Применение MatLab 9

Глава 2 Материалы и методы исследований 10

2.1 Объекты и материалы исследования 10

2.2 Методы исследований 11

2.2.1 Измерение внутриклеточного уровня окислителей 11

2.2.2 Измерение внутриклеточного рН 12

2.2.3 Измерение концентрации цитозольного кальция 13

Глава 3 Результаты исследований 15

3.1 Изучение антиоксидантной активности препаратов в клеточных системах. Исследование взаимосвязи параметров редокс- и рН гомеостазов 15

3.2 Изучение действия редокс-активных молекул на кальциевый гомеостаз опухолевых клеток 19

Заключение 23

Список литературы к реферату 23

Предметный указатель к реферату 25

Интернет ресурсы в предметной области исследования 26

Действующий личный сайт в WWW 27

Граф научных интересов 28

1. Атомная и молекулярная спектроскопия, включая спектроскопию биообъектов, спектроскопия твердого тела. Люминесценция. Первичные фотохимические процессы. Физические основы фотографического процесса. Физиологическая оптика. Оптика мезоскопических структур, нанооптика. 28

1. Биоэнергетика. Макроэргические соединения. Синтез АТФ и субстратное фосфорилирование. Энергетика гликолиза. Спиртовое брожение. Другие типы брожения. Цикл трикарбоновых кислот. Цепь переносчиков энергии в митохондриях. Окислительное фосфорилирование. Сопряжение окисления и фосфорилирования. Молекулярные механизмы энергообеспечения биосинтетических реакций. Трансформации химической энергии АТФ в механическую и осмотическую работу. 28

2. Биохимия регуляторных процессов. Гуморальная регуляция. Геномная и метаболическая регуляция. Гормоны, нейромедиаторы, другие регуляторные молекулы. Рецепторная природа первичного регуляторного акта клетки. Трансдукция рецепторного сигнала. Основные звенья внутриклеточной сигнализации. Рецепторы гормонов, нейромедиаторов и биологически активных веществ. G-белки и их функциональная роль. Вторичные мессенджеры. Аденилат- и гуанилатциклазная системы, фосфоинозитольный цикл и цикл арахидоновой кислоты. Регуляторная роль катионов кальция и окиси азота. 28

1. Теоретическая и математическая биофизика. Термодинамика биологических процессов. Диссипативные структуры в биологии. Колебательные процессы в биологии. Модели биологических процессов. 28

2. Свободно-радикальные процессы в биологии. Супероксидный и гидроксильный радикалы. Парамагнитные центры. Синглетный кислород. Окислительно-восстановительные реакции с участием свободных радикалов и активных форм кислорода в процессах функционирования биосистем. Процессы перекисного окисления липидов в биологических системах. 28

3. Биофизика клетки. Физико-химические свойства клетки и ее элементов. Биофизика клеточных процессов. Механические, осмотические и электрические явления в клетках. Биофизические механизмы клеточного гомеостаза. 28

1. Структурная организация и основы жизнедеятельности клеток и тканей животного организма. 28

2. Регенерация и дифференцировка клеток и тканей, механизмы их регуляции, роль недифференцированных (стволовые) клеток в этих процессах 28

1. Механика клетки. Механические и реологические свойства мембраны. Массоперенос через мембрану 28

2. Движение биологических жидкостей. Состав и реологические свойства крови. Модели растворов биополимеров (суставная жидкость, слизистые жидкости) 28

Тестовые вопросы по Основам информационных технологий 29

Презентация магистерской диссертации 30

Список литературы к выпускной работе 31

Приложение 32





Список обозначений ко всей выпускной работе


ИТ – информационные технологии

АФК – активные формы кислорода

АК – аскорбиновая кислота

НАДН – никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма

PBS – сбалансированный фосфатный буферный солевой раствор

EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота

СБСР – сбалансированный буферный солевой раствор

BCECF – 2,7-бикарбоксил-5(6)-карбоксифлуоресцеин

DMSO – диметилсульфоксид

EGTA – этиленгликоль тетраацетат

H2DCF-DA – 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат

H2DCF – 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин

DCF – 2,7-дихлорофлуоресцеин

Реферат на тему «Перспективы использования ИТ в биофизических исследованиях»

Введение


Современный период развития общества характеризуется сильным влиянием на него компьютерных технологий, которые проникают во все сферы человеческой деятельности, обеспечивают распространение информационных потоков в обществе, образуя глобальное информационное пространство. Они очень быстро превратились в жизненно важный стимул развития не только мировой экономики, но и других сфер человеческой деятельности. Трудно найти сферу, в которой сейчас не используются информационные технологии. Информационные технологии (ИТ) оказывают влияние на все аспекты деятельности человека, существенно увеличивая степень автоматизации всех информационных процессов, что является предпосылкой для ускорения темпов научно-технического прогресса. Несомненно, лидирующей областью по внедрению компьютерных технологий является наука. Информационные технологии повышают уровень эффективности работ в науке за счет упрощения и ускорения процессов обработки, передачи, представления и хранения информации; обеспечение точности и качества решаемых задач; возможности реализации ранее не решаемых задач.

Эффективность научных исследований в значительной степени связана с уровнем использования компьютерной техники. Один из наиболее эффективных методов научного исследования – вычислительный эксперимент позволяет изучать поведение сложных систем, которые трудно физически смоделировать.

Процесс измерения параметров сложных систем сопряжен с обработкой аналогового сигнала измерительной системой, последующим его преобразованием в цифровой и конечной обработкой полученных результатов.

На этапе обработки результатов научных исследований наибольшее применением находят программные средства, обеспечивающие выполнение математических расчетов с использованием теории вероятности, теории ошибок, математической статистики, векторного и растрового анализа изображений.

В настоящей работе будет отражено использование ИТ в биофизических исследованиях [1]. Исследования биологических систем сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, биологические системы являются открытыми нелинейными системами, способными к самоорганизации. Во-вторых, биологические системы в лабораторных условиях обладают малым временем жизни. В связи с этим, используемые в исследованиях методы должны характеризовать высокой чувствительностью, селективностью, не приводить к разрушению самой системы. Все это приводит к тому, что основными методами в биофизических исследованиях становятся косвенные методы исследований, которые позволяют судить об изменениях в биологических системах не напрямую, а исходя из изменений характеристик искусственно вводимых в системы агентов. В связи с этим остро встает вопрос точной обработки и интерпретации получаемых данных.

Все это обуславливает широкую популярность оптических методов исследования. Важное место среди этих методов принадлежит оптической спектроскопии, которая дает информацию о физико-химических свойствах среды, таких как строение молекул, природа химических связей, межмолекулярные взаимодействия, позволяет определить качественно и количественно состав среды; а также флуориметрическим методам анализа, которые позволяют получить информацию о концентрациях веществ в исследуемом образце, оценить кинетические характеристики химических реакций. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и дают универсальные возможности изучения возбужденных состояний молекул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов, структуры и свойств сложных химических и биологических объектов [2].

Для обработки получаемой информации, анализа данных необходимо, чтобы научно-исследовательское оборудование было снабжено сопутствующим программным обеспечением, которое либо позволяло бы проводить полную обработку экспериментальных данных, либо давало возможность сохранять данные в удобном формате для последующей обработки результатов с использованием специальных систем.

Таким образом, на каждом этапе исследования биологической системы (регистрация сигналов, оцифровка аналогового сигнала, накопление данных, создание массива данных, количественная и статистическая обработка данных, визуализация данных) возникает необходимость использования ИТ.


Глава 1 Обзор литературы

1.1 Информационные технологии в научных исследованиях


Еще несколько десятилетий назад единственным способом накопления информации по интересующей исследователя тематике был анализ таких традиционных источников информации, как печатные издания (книги, журналы, справочники). Требовалось очень тщательно выбирать требуемую литературу, искать в ней решения похожих проблем для создания уже решения собственной задачи со своими начальными и граничными условиями. Появление сети Интернет за считанные годы изменило представление об источниках информации. В настоящее время сеть Интернет позволяет найти огромное количество информации, в том числе и данные, которые когда-либо были произведены на бумажных носителях. Таким образом, поиск информации производится гораздо быстрее с несоизмеримо большим выбором.

В настоящее время в сети Интернет Представлен широкий выбор Научных поисковых систем. Система Scirus позволяет осуществлять полнотекстовый поиск по статьям журналов большинства крупных иностранных издательств (порядка 17 млн. статей), статьям в крупных архивах статей и препринтов, научным ресурсам Internet (более 250 млн. проиндексированных страниц). Science Research Portal позволяет осуществлять полнотекстовый поиск в журналах многих крупных научных издательств, таких как Elsevier, Highwire, IEEE, Nature, Taylor & Francis и др. Ищет статьи и документы в открытых наунчных базах данных: Directory of Open Access Journals, Library of Congress Online Catalog, Science.gov и Scientific News. Особый интерес для исследователей в области биофизики представляют системы Medline и HighWire Press, позволяющие осуществлять поиск по статьям медицинской тематики.

Анализ данных последних лет позволяет утверждать, что в настоящее время особую нишу в биофизических исследованиях клетках занимают исследования редокс-регуляции клеточных процессов. Основу редокс-регуляции составляют механизмы, обеспечивающие межмолекулярный перенос электронов. При переносе электронов между компонентами жидкой фазы в клетке и внутриклеточными белками изменяются свойства белков и клетки в целом. Доноры и акцепторы электронов участвуют в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток [3]. Показано, что нарушение редокс-гомеостаза является признаком развития многих заболеваний, включая атеросклероз, диабет, рак, болезнь Альцгеймера, ишемическую болезнь сердца. Сопутствующим признаком ряда заболеваний являются также изменения кислотно-основного состояния [4]. В этих условиях функциональный ответ клеток на действие окислителей и восстановителей может значительно отличаться от функционального ответа клеток в норме. Одним из ранних ответов сигнальных систем на изменение концентрации окислителей во многих типах клеток является повышение внутриклеточной концентрации несвязанного кальция [5]. Регуляция внутриклеточной концентрации несвязанного кальция представляет один из способов передачи внеклеточной информации на внутриклеточные эффекторы. Высвобождение Са2+ из кальциосом при действии окислителей может иметь регуляторное значение и протекать при физиологических условиях. Выход Са2+ из митохондрий при действии окислителей происходит при патофизиологических условиях и служит важным звеном в механизмах гибели клеток [3].

Несмотря на то, что зависимость активности отдельных участников регуляции кальциевого, рН и редокс-гомеостазов от величины внутриклеточного рН и параметров редокс-состояния не вызывает сомнений [4], взаимосвязь между процессами регуляции кислотно-основного состояния, редокс-состояния и кальциевой сигнализации клеток не обоснована. Проблема исследования взаимосвязи между параметрами кальциевого, рН и редокс-гомеостазов в клетках в норме и при патологии заключается в том, что возможно проводить лишь косвенные измерения изменений физико-химических параметров при протекании реакций. Основным таким методом исследований в биофизике клетки является метод флуоресцентного анализа.

Использование в своих исследованиях современного оборудования – спектрофлуориметра СМ 2203 – позволяет получить информацию о протекающих в клеточных системах изменениях. Стоит отметить, что Web-сайт производителя данного оборудования позволяет получить необходимую информацию о технических характеристиках прибора, чувствительности регистрирующей системы, измерительных функциях, сопутствующем программном обеспечении.

Необходимо отметить, что данное ПО не позволяет осуществлять полный анализ получаемых данных и решить следующие задачи:

1. Определение характеристических параметров;

2. Численная обработка полученных данных;

3. Статистическая обработка данных;

4. Графическое представление имеющихся данных.

Для успешного решения поставленных задач могут быть использованы следующие программные средства: Microsoft Office Excel, Origin, Mathematica, MatLab. В данной работе рассмотрим обработку данных с использованием MatLab.

1.2 Среда MatLab


Название MatLab является сокращением от Matrix Laboratory, создан компанией MathWorks около 20 лет назад, постоянно происходит расширение его возможностей и совершенствование заложенных алгоритмов. В настоящее время MatLab является мощным и универсальным средством решения задач, возникающих в различных областях человеческой деятельности. MatLab работает на большинстве современных операционных систем, включая Linux, Mac OS, Solaris и Microsoft Windows [6].

1.2.1 Описание языка


Язык MatLab является высокоуровневым интерпретируемым языком программирования, включающим основанные на матрицах структуры данных, широкий спектр функций, интегрированную среду разработки, объектно-ориентированные возможности и интерфейсы к программам, написанным на других языках программирования.

Программы, написанные на MatLab, бывают двух типов – функции и скрипты. Функции имеют входные и выходные аргументы, а также собственное рабочее пространство для хранения промежуточных результатов вычислений и переменных. Скрипты же используют общее рабочее пространство. Как скрипты, так и функции не компилируются в машинный код и сохраняются в виде текстовых файлов. Существует также возможность сохранять так называемые pre-parsed программы – функции и скрипты, обработанные в вид, удобный для машинного исполнения. В общем случае такие программы выполняются быстрее обычных, особенно если функция содержит команды построения графиков.


1.2.2 Применение MatLab


MatLab позволяет решать ряд задач, возникающих в процессе обработки экспериментальных данных. В данном разделе рассмотрим некоторые возможности MATLAB, которые наиболее часто используются в биофизических исследованиях.

  1. Математика и вычисления

MatLab предоставляет пользователю большое количество (несколько сотен) функций для анализа данных, покрывающие практически все области математики, в частности:

Матрицы и линейная алгебра – алгебра матриц, линейные уравнения, собственные значения и вектора, сингулярности, факторизация матриц и другие.

Многочлены и интерполяция – корни многочленов, операции над многочленами и их дифференцирование, интерполяция и экстраполяция кривых и другие.

Математическая статистика и анализ данных – статистические функции, статистическая регрессия, цифровая фильтрация, быстрое преобразование Фурье и другие.

Обработка данных – набор специальных функций, включая построение графиков, оптимизацию, поиск нулей, численное интегрирование (в квадратурах) и другие.

Дифференциальные уравнения – решение дифференциальных и дифференциально-алгебраических уравнений, дифференциальных уравнений с запаздыванием, уравнений с ограничениями, уравнений в частных производных и другие.

Разреженные матрицы – специальный класс данных пакета MATLAB, использующийся в специализированных приложениях.

Целочисленная арифметика – выполнение операций целочисленной арифметики в среде MatLab.



  1. Разработка алгоритмов

MatLab предоставляет удобные средства для разработки алгоритмов, включая высокоуровневые с использованием концепций объектно-ориентированного программирования. В нём имеются все необходимые средства интегрированной среды разработки, включая отладчик и профайлер. Функции для работы с целыми типами данных облегчают создание алгоритмов для микроконтроллеров и других приложений, где это необходимо.

  1. Визуализация данных

В составе пакета MatLab имеется большое количество функций для построения графиков, в том числе трёхмерных, визуального анализа данных и создания анимированных роликов.

Встроенная среда разработки позволяет создавать графические интерфейсы пользователя с различными элементами управления, такими как кнопки, поля ввода и другими. С помощью компонента MatLab Compiler эти графические интерфейсы могут быть преобразованы в самостоятельные приложения, для запуска которых на других компьютерах необходима установленная библиотека MatLab Component Runtime.



  1. Внешние интерфейсы

Пакет MatLab включает различные интерфейсы для получения доступа к внешним подпрограммам, написанным на других языках программирования, данным, клиентам и серверам, общающимся через технологии Component Object Model или Dynamic Data Exchange, а также периферийным устройствам, которые взаимодействуют напрямую с MatLab. Многие из этих возможностей известны под названием MatLab API [6].

Глава 2 Материалы и методы исследований

2.1 Объекты и материалы исследования


В работе использовали кровь здоровых доноров. Лейкоцитарный слой и плазму крови отделяли после трехкратного восьмиминутного центрифугирования при 1500 об/мин. Также использовались клетки карциномы гортани человека линии HEp-2. Культуры клеток линии HEp-2 были приобретены в Институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Исследования проводили в сбалансированном фосфатном буферном растворе PBS следующего состава: NaCl – 137 ммоль/л, KCl – 2.7 ммоль/л, Na2HPO4 – 8.0 ммоль/л, KH2PO4 – 1.5 ммоль/л, рН = 7.4; или: 0.137 М NaCl – 0.137 ммоль/л, 2.7 мM KCl – 2.7 ммоль/л, Na2HPO4 – 8.0 ммоль/л, KH2PO4 – 8.0 ммоль/л, рН = 6.73. Использовался также сбалансированный буферный солевой раствор СБСР следующего состава: NaCl – 131 ммоль/л, KCl – 5 ммоль/л, CaCl2 – 1,3 ммоль/л, MgSO4 – 1,3 ммоль/л, Hepes – 20 ммоль/л, глюкоза – 6 ммоль/л, рН 7,4. В раствор, не содержащий ионов Са2+, вместо CaCl2 добавляли 0,1 ммоль/л EGTA.

В экспериментах использовали пероксид водорода, натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, магния сульфат, калия фосфат, натрия гидроокись, глюкозу, аскорбиновую кислоту (Анализ-Х, Беларусь), Hepes, Fura 2-AM, BCECF, DMSO, EGTA, H2DCF-DA, тапсигаргин, иономицин, антимицин А, ротенон («Sigma», США).

2.2 Методы исследований

2.2.1 Измерение внутриклеточного уровня окислителей


Все флуоресцентные измерения в работе проведены с использованием спектрофлуориметра LSF 1211А научно-производственного центра «СОЛАР» (Минск, Беларусь).

Измерение внутриклеточного уровня окислителей проводили с использованием флуоресцентного зонда 2,7-дихлородигидрофлуоресцеина (H2DCF). Процедура загрузки клеток реактивом H2DCF-DA содержала следующие этапы:

1. Реактив H2DCF-DA в порошкообразной форме разводили в DMSO до конечной концентрации 10 ммоль/л. Раствор замораживали и хранили при температуре минус 20°С. Перед экспериментом раствор H2DCF-DA в диметилсульфоксиде нагревали до комнатной температуры и разводили в PBS до конечной концентрации 10 мкмоль/л.

2. Суспензию клеток (5х107 клеток/мл) нагружали флуоресцентным индикатором H2DCF-DA в процессе инкубации клеток в фосфатном буфере с 10 мкмоль/л H2DCF-DA в течение 30-45 минут при температуре 37 °С.

3. Затем клетки дважды отмывали в PBS с рН = 7,4 или с рН = 6,7 в зависимости от цели эксперимента. Клетки разделяли на равные пробы (5х106 клеток/мл) и хранили при температуре 4оС до проведения эксперимента (не более одного часа).

Изменение внутриклеточной концентрации окислителей определяли с помощью анализа интенсивностей флуоресцентных сигналов, записанных при длине возбуждения 488 нм и длине флуоресценции 530 нм. Определение параметров редокс-состояния проводили на основе анализа скорости изменения интенсивности флуоресценции зонда при его окислении.


2.2.2 Измерение внутриклеточного рН


Изменение внутриклеточного рН оценивали при помощи флуоресцентного зонда 2,7-бикарбоксил-5(6)-карбоксифлуоресцеина (BCECF). Процедура загрузки клеток реактивом BCECF содержала следующие этапы:

  1. Реактив BCECF в порошкообразной форме разводили в DMSO до конечной концентрации 1,6 ммоль/л. Раствор замораживали и хранили при температуре минус 20°С. Перед экспериментом раствор BCECF в диметилсульфоксиде нагревали до комнатной температуры и разводили в PBS в соотношении до конечной концентрации 6,5 мкмоль/л.

  2. Суспензию клеток нагружали флуоресцентным индикатором BCECF в концентрации 8 мкмоль/л BCECF в течение 45 минут при температуре 37 °С.

  3. После этого клетки дважды отмывали в СБСР (рН = 7,4). Клетки разделяли на равные пробы (5х106 клеток/мл для эритроцитов, 2,5×106 клеток/мл для НЕр-2) и хранили при температуре 4оС до проведения эксперимента (не более одного часа).

Изменение внутриклеточного рН определяли с помощью анализа интенсивностей флуоресцентных сигналов, записанных при длинах волн возбуждения 440 нм и 490 нм и длине волны флуоресценции 530 нм.

В процессе исследований нами разработана методика определения значения внутриклеточного рН, не требующая для получения калибровочного графика использования нигерицина. Для определения значения внутриклеточного рН рассчитывалось отношение интенсивностей флуоресценции внутриклеточного BCECF, которое затем переводилось в линейную шкалу рН, построенную в результате калибровки по реперным точкам, полученным в конце эксперимента путем измерения I490/440 при известных значениях внеклеточного рН. Данные значения были получены в результате разрушения эритроцитов 0.1% раствором Triton X-100 и последующим выходом BCECF во внеклеточную среду, рН которой известно из условий эксперимента.





Рисунок 1 – Калибровочный график зависимости отношения интенсивностей флуоресценции BCECF (490/440 нм) от lg(pHin)

На основании калибровочного графика (рисунок 1) выведено соотношение, позволяющее рассчитать значение внутриклеточного рНin:



, (2.1)

где I490/440 – отношение интенсивностей флуоресценции BCECF на длинах волн возбуждения 490 нм и 440 нм, А и В – коэффициенты, определяемые из уравнения прямой.


2.2.3 Измерение концентрации цитозольного кальция


Для мониторинга изменений внутриклеточной концентрации несвязанного кальция использовался флуоресцентный зонд Fura 2-AM (химическая формула – C44H47N3O24). Для загрузки клеток реактивом Fura 2 использовали ацетилметиловый эфир данного реактива. Ацетилметиловый эфир реактива легко проникает через мембрану и не связываться с ионами Са2+. Внутри клетки под действием эстераз происходит разрыв эфирных связей и реактив переходит в Са2+-связывающую форму. Процедура загрузки клеток реактивом Fura 2-AM содержала следующие этапы:

1. Реактив Fura 2-AM в порошкообразной форме разводили в DMSO до конечной концентрации 250 мкмоль/л. Раствор замораживали и хранили при температуре минус 20°С. Перед экспериментом раствор Fura 2-AM в диметилсульфоксиде нагревали до комнатной температуры и разводили в СБСР в соотношении 1:100 до конечной концентрации 2,5 мкмоль/л.

2. Суспензию клеток (7,5×106 клеток/мл) нагружали флуоресцентным кальциевым индикатором Fura 2-AM в процессе инкубации клеток в СБСР с 2,5 мкмоль/л Fura 2-AM в течение 30-45 минут при температуре 37°С.

3. После этого клетки дважды отмывали в СБСР и снова инкубировали в течение 15-30 минут при температуре 37°С для протекания процесса деэфиризации.

4. После деэфиризации клетки омывали в СБСР. Клетки разделяли на равные пробы (2,5×106 клеток/мл) и хранили при температуре 4°С до проведения эксперимента (не более одного часа).

Для определения изменений внутриклеточной концентрации несвязанного кальция использовалось соотношение величин флуоресцентных сигналов, зарегистрированных с помощью спектрофлуориметра, при разных длинах волн возбуждения. Данная методика позволяет получать результаты, которые не зависят от оптических свойств регистрирующей системы и интенсивности флуоресцентного сигнала исследуемого объекта.

Для определения внутриклеточной концентрации, полученных для спектров возбуждения Fura 2, в основном используются данные для двух длин волн – 340 нм и 380 нм, длина волны излучения при этом составляет 510 нм. Расчет внутриклеточной концентрации кальция обычно производится с помощью формулы Гринкевица:

(2.2)

где [Ca2+]цит – внутриклеточная концентрация несвязанного кальция, Kd – константа диссоциации комплекса Fura-2 с ионами, В – отношение интенсивности флуоресценции для длины волны возбуждения 380 нм при максимальной концентрации кальция в растворе к интенсивности флуоресценции для длины волны возбуждения 380 нм при минимальной концентрации кальция, R – отношение интенсивности флуоресценции для длины волны возбуждения 340 нм к интенсивности флуоресценции для длины волны возбуждения 380 нм при измеряемой концентрации кальция в клетках, Rmin – отношение интенсивностей флуоресценции (340:380) при минимальной концентрации кальция (10-8 моль/дм3) в растворе, Rmax – отношение интенсивностей флуоресценции (340:380) при максимальной концентрации кальция (10-3 моль/дм3) в растворе.


Глава 3 Результаты исследований

3.1 Изучение антиоксидантной активности препаратов в клеточных системах. Исследование взаимосвязи параметров редокс- и рН гомеостазов


Для окислительно-восстановительной реакции типа

(3.1)

количественная зависимость величины редокс-потенциала от химической природы редокс-пары, температуры, отношения концентраций окисленной и восстановленной форм вещества устанавливается уравнением Нернста:



, (3.2)

где Е – восстановительный потенциал редокс-пары; Е0 – стандартный восстановительный потенциал; R – универсальная газовая постоянная (R = 8,314 Дж К-1 М-1); Т – температура (К); F – постоянная Фарадея (F=9,6485104 Кл М-1); z – число электронов, которые присоединяет молекула окисленной формы Аок, переходя в восстановленную форму вещества Авос; [Aок] – концентрация окисленной формы вещества; [Авос] – концентрация восстановленной формы вещества.

Показано, что в эритроцитах величина скорости окисления H2DCF (Vф) прямо пропорциональна величине изменения эффективного редокс-потенциала, то есть

. (3.3)

Величину скорости окисления Vф определяется по формуле:



, (3.4)

где I300 – интенсивность флуоресценции DCF через 300 с после добавления Н2О2, I0 – начальная интенсивность флуоресценции DCF. То есть, мониторинг изменения параметров редокс-состояния эритроцитов можно проводить с использованием флуоресцентного зонда H2DCF.

Следует отметить, что программа регистрации данных на использованном спектрофлуориметре позволяет выводить данные в формате ASCII, однако не обладает возможностью для их первоначальной обработки. MATLAB позволяет визуализировать полученные данные (рисунок 2).



Рисунок 2 – Влияние Н2О2 на интенсивность флуоресценции DCF (Iфл, отн.ед.) в суспензии эритроцитов в присутствии аскорбиновой кислоты (АК). Концентрация АК – 100 мкмоль/л. Концентрация эритроцитов в мл – 5´106

Получив аналогичные зависимости интенсивности флуоресценции DCF в суспензиях клеток в присутствии различных редокс-активных молекул (АК, как представлено на рис., а также фенольных антиоксидантов), можно, произведя необходимые вычисления (формула 3.4), получить зависимости, которые позволяют судить об антиоксидантной эффективности исследуемых образцов (лекарственных препаратов). Стоит отметить, что для получения достоверных результатов в биофизических исследованиях необходимо проведение серии экспериментов и дальнейшая статистическая обработка результатов. Ниже приведен отрывок кода обработки результатов, где помимо преобразования кинетических характеристик реакций в удобные для анализа параметры, произведен расчет стандартных ошибок:

% Строим для ФК

A=load('Kontrol_15.txt');

B=load('Kontrol_18.txt');

C=load('Kontrol_22_1.txt');

D=load('Kontrol_22_2.txt');

E=load('Kontrol_24.txt');

F=load('Kontrol_25.txt');

K1=[A(1) B(1) C(1) D(1) E(1) F(1)];

K2=[A(2) B(2) C(2) D(2) E(2) F(2)];

K3=[A(3) B(3) C(3) D(3) E(3) F(3)];

K4=[A(4) B(4) C(4) D(4) E(4) F(4)];

KK=[mean(K1) mean(K2) mean(K3) mean(K4)];

Con=[A(5) A(6) A(7) A(8)];

SK=[std(K1,1) std(K2,1) std(K3,1) std(K4,1)];

errorbar(Con,KK,SK)

xlabel('1/[H{_2}O{_2}]'), ylabel('1/V{_фл}')

hold on

% Строим для ТС-13



ATC=load('TC_15.txt');

BTC=load('TC_18.txt');

CTC=load('TC_22.txt');

DTC=load('TC_24.txt');

ETC=load('TC_25.txt');

TC1=[ATC(1) BTC(1) CTC(1) DTC(1) ETC(1)];

TC2=[ATC(2) BTC(2) CTC(2) DTC(2) ETC(2)];

TC3=[ATC(3) BTC(3) CTC(3) DTC(3) ETC(3)];

TC4=[ATC(4) BTC(4) CTC(4) DTC(4) ETC(4)];

TC=[mean(TC1) mean(TC2) mean(TC3) mean(TC4)];

Con=[A(5) A(6) A(7) A(8)];

STC=[std(TC1,1) std(TC2,1) std(TC3,1) std(TC4,1)];

errorbar(Con,TC,STC,'green')

hold on


% Строим БЭК-11-К

ABEK=load('BEK_22.txt');

BBEK=load('BEK_24.txt');

CBEK=load('BEK_25.txt');

BEK1=[ABEK(1) BBEK(1) CBEK(1)];

BEK2=[ABEK(2) BBEK(2) CBEK(2)];

BEK3=[ABEK(3) BBEK(3) CBEK(3)];

BEK4=[ABEK(4) BBEK(4) CBEK(4)];

BEK=[mean(BEK1) mean(BEK2) mean(BEK3) mean(BEK4)];

Con=[A(5) A(6) A(7) A(8)];

SBEK=[std(BEK1,1) std(BEK2,1) std(BEK3,1) std(BEK4,1)];

errorbar(Con,BEK,SBEK,'red')

K=[Con; BEK; SBEK]'

hold on


FFKK=load('FFKK.txt');

SFFK=load('SFFK.txt');

errorbar(Con,FFKK,SFFK,'*-k');

Результат представленных расчетов приведен на рисунке 3.





Рисунок 3 – Зависимость скорости окисления H2DCF пероксидом водорода в суспензии эритроцитов в присутствии антиоксидантных препаратов БЭК-11-К, ТС-13, ФК, представленная в обратных координатах. Концентрация БЭК-11-К, ТС-13, ФК – 100 мкмоль/л. Концентрация эритроцитов в мл – 5´106

По углу наклона графиков можно судить об антиоксидантной эффективности исследуемых препаратов. Чем больше угол наклона графика, тем эффективнее препарат перехватывает пероксид водорода, присутствующий в системе, и, тем самым, предотвращает окислительные повреждения клеток.

Аналогичные зависимости интенсивности флуоресценции DCF в эритроцитах от времени инкубирования с Н2О2 в концентрации 1 ммоль/л получены при различных значениях рН внеклеточной среды.

С использованием представленного метода анализа экспериментальных данных установлено, что скорость окисления H2DCF в эритроцитах уменьшается в ФСБ с высокими значениями рН и увеличивается в ФСБ с низкими значениями рН. Измерения внутриклеточного рН с помощью флуоресцентного зонда BCECF показали, что величина внутриклеточного рН уменьшается при снижении величины внеклеточного рН. Таким образом показано, что параметры редокс-состояния клеток зависят от величины рН внутриклеточной среды. При снижении величины рН увеличивается смещение величины эффективного редокс-потенциала, индуцируемое Н2О2.


3.2 Изучение действия редокс-активных молекул на кальциевый гомеостаз опухолевых клеток


Для углубления представлений о взаимосвязи различных механизмов регуляции функциональных ответов клеток особый интерес представляет изучение действия химических агентов, способных участвовать как в процессах редокс-регуляции, так и в процессах регуляции рН гомеостаза. Нами показано, что одним из таких агентов является аскорбиновая кислота. Аскорбиновая кислота (АК) индуцирует повышение концентрации цитозольного Са2+. АК вызывает скачкообразное изменение внутриклеточной концентрации несвязанного кальция в клетках HEp-2.

Для определения концентрации несвязанных ионов кальция в цитозоле опухолевых клеток используется флуоресцентный зонд Fura-2 AM. Измерения проводятся при возбуждении на длинах волн 340 нм и 380 нм, а регистрируют флуоресценцию при 530 нм. Для того, чтобы преобразовывать данные об отношении интенсивностей флуоресценции при возбуждении на указанных длинах волн в концентрацию несвязанных ионов кальция производят в соответствии с методикой калибровку зонда в растворах с известными концентрациями несвязанных ионов кальция. Отрывок кода определения параметров, необходимых для преобразования отношения интенсивностей флуоресценции при возбуждении на указанных длинах волн в концентрацию несвязанных ионов кальция, приведен ниже (расчеты в Mathematica):

data=Import["C:\\Users\\****\\*******\\*******_2009_2010\\271009\\1SPTB.txt","Table"];

H=Table[data[[j]],{j,42,42}];

T=Table[data[[i]],{i,Length[data]-22,Length[data]-22}];

F=Table[i-1,{i,2},{j,1}];

L=H.F;

K=T.F;


data1=Import["C:\\Users\\****\\*******\\*******_2009_2010\\271009\\4SPTB.txt","Table"];

U=Table[data1[[j]],{j,42,42}];

Y=Table[data1[[i]],{i,Length[data1]-22,Length[data1]-22}];

M=U.F;


MM=Y.F;

Rmax=L/K;

Rmin=M/MM;

B=MM/K;


Export["C:\\Users\\****\\*******\\*******_2009_2010\\Parameters.txt",Flatten[{Rmax,Rmin,B}],"Table"]

В дальнейшем анализе и численной обработке данных будут использованы полученные при данной калибровке значения параметров.

Использование соответствующих методик позволило установить, что величина изменения [Ca2+]цит увеличивается при увеличении концентрации аскорбиновой кислоты (рисунок 4).



Рисунок 4 – Влияние аскорбиновой кислоты на внутриклеточную концентрацию несвязанных ионов Са2+ в клетках HEp-2. Концентрация аскорбиновой кислоты в СБСР: 1 – 5 ммоль/л, 2 – 10 ммоль/л. Концентрация клеток карциномы HEp-2 в мл – 2,5´106

Нами установлено, что аскорбиновая кислота индуцирует выход ионов Са2+ из тапсигаргин-чувствительных Са2+-депо. При действии тапсигаргина, выход Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо активирует последующий за опустошением депо вход ионов Са2+ в клетку посредством активации Са2+-каналов плазматической мембраны. После опустошения внутриклеточных Са2+-депо тапсигаргином аскорбиновая кислота не вызывает увеличения внутриклеточной концентрации несвязанного кальция. Добавление аскорбиновой кислоты в суспензию клеток на второй стадии тапсигаргин-индуцированного повышения внутриклеточной концентрации несвязанного кальция вызывает снижение внутриклеточной концентрации несвязанных ионов.

Известно, что тапсигаргин индуцирует высвобождение ионов Са2+ из митохондрий и инозитол-1,4,5-трифосфат-чувствительных Ca2+-депо. При предварительной инкубации клеток НЕр-2 с ротеноном (ингибитором переноса электронов в комплексе I дыхательной цепи митохондрий) амплитуда кальциевого ответа, индуцируемого действием 5 ммоль/л аскорбиновой кислоты, уменьшается при увеличении концентрации ротенона (рисунок 5). Таким образом, АК инициирует высвобождение кальция из митохондрий опухолевых клеток.

Ниже приведен отрывок кода, позволяющий визуализировать полученные данные, а также представлен сам рисунок:

A1=load(Rotenone_1.TXT');

B1=[0 50 100 150];

A2=load(Rotenone_2.TXT');

B2=[150 100 50 0];

K=[A1(1) A2(1)];

L=[A1(2) A2(2)];

M=[A1(3) A2(3)];

N=[A1(4) A2(4)];

s1=std(K,1);

s2=4.3*std(L,1);

s3=4.3*std(M,1);

s4=4.3*std(N,1);

A=[mean(K) mean(L) mean(M) mean(N)]

S=[s1 s2 s3 s4]

errorbar(B1,A,S,'.')

xlabel('Концентрация ротенона, мкмоль/л','FontSize',12,'FontName','Times New Roman')

ylabel('[Ca^{2+}]_{цит}, нмоль/л','FontSize',12,'FontName','Times New Roman')



Рисунок 5 – Влияние АК на повышение внутриклеточной концентрации несвязанных ионов Са2+ в клетках HEp-2 при загрузке ротеноном. Концентрация аскорбиновой кислоты в СБСР – 5 ммоль/л. Концентрация клеток карциномы HEp-2 в мл – 2,5´106

Полученные результаты позволили установить механизм действия АК на кальциевый гомеостаз опухолевых клеток и локализовать мишень действия АК.

Показано, что в присутствии антимицина А (ингибитора переноса электронов в комплексе III дыхательной цепи митохондрий) наблюдается увеличение амплитуды и длительности аскорбат-индуцированного кальциевого ответа (рисунок 6). В свою очередь, антимицин А в концентрациях до 15 мкмоль/л не вызывает изменений [Ca2+]цит. После действия аскорбиновой кислоты добавление антимицина А в суспензию клеток индуцирует резкое увеличение [Ca2+]цит. Последующее добавление ротенона (ингибитора переноса электронов в комплексе I дыхательной цепи митохондрий) приводит к снижению [Ca2+]цит в опухолевых клетках НЕр-2.



Рисунок 6 – Влияние антимицина А (АмА) на аскорбат-индуцированное высвобождение ионов Са2+ в цитозоль клеток HEp-2. Концентрация АмА в СБСР: 1 – контроль, 2 – 10 мкмоль/л, 3 – 15 мкмоль/л. Концентрация аскорбиновой кислоты в СБСР – 5 ммоль/л. Концентрация клеток карциномы человека HEp-2 в мл – 2,5´106

На основании результатов проведенных исследований, а также качественного и количественного анализа полученных данных был установлен механизм действия АК. Аскорбат-индуцированное высвобождение ионов кальция в цитозоль из митохондрий клеток НЕр-2 происходит с участием активных форм кислорода (АФК), образующихся в дыхательной цепи митохондрий. Аскорбиновая кислота, являясь донором электронов для комплекса III дыхательной цепи митохондрий, приводит к усилению образования Н2О2 этим комплексом. Антимицин А также активирует образование Н2О2 комплексом III, приводящее к увеличению аскорбат-индуцированного кальциевого ответа клеток. Ротенон, в свою очередь, ингибирует повышение [Ca2+]цит, вызванное действием аскорбиновой кислоты и антимицина А, поскольку блокирует перенос электронов в комплексе I дыхательной цепи и ингибирует образование Н2О2 в комплексе III. Снижение внутриклеточного рН приводит к усилению окислительных процессов в клетке, поэтому после действия аскорбиновой кислоты увеличение внутриклеточной концентрации несвязанного кальция антимицином А наблюдается даже при низких концентрациях ингибитора. Таким образом, аскорбат-индуцированное высвобождение ионов кальция в цитозоль из митохондрий клеток НЕр-2 связано как с донорно-акцепторными, так и с кислотно-основными свойствами аскорбиновой кислоты.


Заключение


В представленной работе показано, что проведение биофизических исследований на современном уровне невозможно без использования информационных технологий на каждом из этапов исследований.

Также проведен подробный анализ методик биофизических исследований, включающих в себя методы оценки антиоксидантной эффективности препаратов, определения редокс-статуса клеток, регистрации изменения цитозольной концентрации несвязанных ионов кальция.

На примере исследований, направленных на установление взаимосвязи между параметрами редокс-, рН и кальциевого гомеостазов продемонстрирована возможность использования MatLab и Mathematica для проведения количественного анализа получаемых данных, построения алгоритмов расчета параметров, преобразования данных в более удобный для качественного и количественного анализа вид. Также было продемонстрировано, как с использованием ИТ построен механизм действия аскорбиновой кислоты на кальциевый гомеостаз опухолевых клеток, а также показана взаимосвязь параметров редокс-, рН и кальциевого гомеостазов.

Созданные в процессе выполнения данной работы алгоритмы могут быть использованы в дальнейших исследованиях биологических объектов, а также при оценке эффективности действия медицинских препаратов.


Список литературы к реферату


  1. Елисеев А.А. Применение компьютерных и информационных технологий в медицине / А.А. Елисеев [и др.] // Вестник Томского ГУ. – 2000. – №269. – С. 113-117.

  2. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии // Пер. с англ. М., 1986. – 453 с.

  3. Мартинович, Г.Г. Окислительно-восстановительные процессы в клетках / Г.Г. Мартинович, С.Н. Черенкевич.   Мн.: БГУ, 2008. – 155 c.

  4. Feurvay, D. The regulation of intracellular pH in the diabetic myocardium / D. Feurvay // Cardiovascular Research.   1997.   V. 34.   P. 48-54.

  5. Gordeeva, A.V. Cross-Talk between reactive oxygen species and calcium in living cells / A. V. Gordeeva [et al.]. // Biochemistry.  2003.   Vol. 68, No.10.   P. 1077-1080.

  6. Ануфриев, И.Е. MATLAB 7 – СПб.: БХВ-Петербург, 2005. – 1104 с.: ил.

Предметный указатель к реферату


B

BCECF 4, 11, 12, 13, 18

D

DCF 4, 15, 16, 18



DMSO 4, 11, 12, 13

E

EDTA 4



EGTA 4, 11

F

Fura-2 14, 19



H

H2DCF 4, 11, 15, 18

H2DCF-DA 4, 11

M

Mathematica 8, 19, 23



MatLab 8, 9, 10, 23, 26

P

PBS 4, 11, 12



А

АК 4, 11, 16, 19, 20, 21, 22, 23

АФК 4, 22

б

биофизический 5, 6, 7, 9, 16, 23, 28



и

измерения 5, 8, 11, 12

интернет 7, 26, 30

исследования 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 26, 28

И

ИТ 1, 4, 5, 6, 23, 29, 31



Н

НАДН 4


р

редокс 7, 8, 12, 15, 16, 18, 19, 23

С

СБСР 4, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22



с

спектрофлуориметр 8, 11, 14, 15

ф

флуоресцентный зонд 13, 19





Интернет ресурсы в предметной области исследования


  1. http://vac.org.by – сайт Высшей аттестационной комиссии Республики Беларусь. Здесь собраны все нормативные акты, касающиеся оформления и защиты диссертаций.

  2. http://solar.by/ – официальный Web-ресурс ЗАО «Спектроскопия, Оптика и Лазеры - Авангардные Разработки».

  3. http://www.mathworks.com/ – официальный Web-ресурс разработчика MatLab The MathWorks

  4. http://www.mathworks.com/support/books/index_by_languagetitle.html?language=15&sortby=title – библиотека русскоязычной литературы на сайте разработчика The MathWorks

  5. http://plplot.sourceforge.net/ – библиотека визуализации PLPlot

Действующий личный сайт в WWW


http://golubevstreet@narod.ru

Граф научных интересов


магистранта Голубевой Е.Н. факультет физический

Специальность 03.00.00 – биологические науки



Смежные специальности

01.04.05 - оптика

1.Атомная и молекулярная спектроскопия, включая спектроскопию биообъектов, спектроскопия твердого тела. Люминесценция. Первичные фотохимические процессы. Физические основы фотографического процесса. Физиологическая оптика. Оптика мезоскопических структур, нанооптика.




03.00.04 – биохимия

1.Биоэнергетика. Макроэргические соединения. Синтез АТФ и субстратное фосфорилирование. Энергетика гликолиза. Спиртовое брожение. Другие типы брожения. Цикл трикарбоновых кислот. Цепь переносчиков энергии в митохондриях. Окислительное фосфорилирование. Сопряжение окисления и фосфорилирования. Молекулярные механизмы энергообеспечения биосинтетических реакций. Трансформации химической энергии АТФ в механическую и осмотическую работу.

2.Биохимия регуляторных процессов. Гуморальная регуляция. Геномная и метаболическая регуляция. Гормоны, нейромедиаторы, другие регуляторные молекулы. Рецепторная природа первичного регуляторного акта клетки. Трансдукция рецепторного сигнала. Основные звенья внутриклеточной сигнализации. Рецепторы гормонов, нейромедиаторов и биологически активных веществ. G-белки и их функциональная роль. Вторичные мессенджеры. Аденилат- и гуанилатциклазная системы, фосфоинозитольный цикл и цикл арахидоновой кислоты. Регуляторная роль катионов кальция и окиси азота.






Основная специальность

03.00.02 – биофизика

1.Теоретическая и математическая биофизика. Термодинамика биологических процессов. Диссипативные структуры в биологии. Колебательные процессы в биологии. Модели биологических процессов.

2.Свободно-радикальные процессы в биологии. Супероксидный и гидроксильный радикалы. Парамагнитные центры. Синглетный кислород. Окислительно-восстановительные реакции с участием свободных радикалов и активных форм кислорода в процессах функционирования биосистем. Процессы перекисного окисления липидов в биологических системах.

3.Биофизика клетки. Физико-химические свойства клетки и ее элементов. Биофизика клеточных процессов. Механические, осмотические и электрические явления в клетках. Биофизические механизмы клеточного гомеостаза.





Сопутствующие специальности

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

1.Структурная организация и основы жизнедеятельности клеток и тканей животного организма.

2.Регенерация и дифференцировка клеток и тканей, механизмы их регуляции, роль недифференцированных (стволовые) клеток в этих процессах






01.02.08 – биомеханика

(включен в область исследований)

1.Механика клетки. Механические и реологические свойства мембраны. Массоперенос через мембрану

2.Движение биологических жидкостей. Состав и реологические свойства крови. Модели растворов биополимеров (суставная жидкость, слизистые жидкости)





Тестовые вопросы по Основам информационных технологий




01 Элемент в языке HTML,который определяет свойства отдельного фрейма, на которые делится окно браузера:



head

frameset

frame

iframe







01 В стиле содержится следующая информация о формате текста:



шрифт, его размер и цвет

шрифт, его размер и цвет,отступы, межзнаковые пробелы и междустрочные интервалы, позиции табуляции, а также специальные элементы форматирования, такие как нумерованные списки

отступы, межзнаковые пробелы и междустрочные интервалы

позиции табуляции и специальные элементы форматирования, такие как нумерованные списки




Презентация магистерской диссертации


Презентация доступна через Интернет. Черно-белые выдачи представлены в ПРИЛОЖЕНИИ.

Список литературы к выпускной работе


1. Елисеев А.А. Применение компьютерных и информационных технологий в медицине / А.А. Елисеев [и др.] // Вестник Томского ГУ. – 2000. – №269. – С. 113-117.

2. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии // Пер. с англ. М., 1986. – 453 с.

3. Мартинович, Г.Г. Окислительно-восстановительные процессы в клетках / Г.Г. Мартинович, С.Н. Черенкевич.   Мн.: БГУ, 2008. – 155 c.

4. Feurvay, D. The regulation of intracellular pH in the diabetic myocardium / D. Feurvay // Cardiovascular Research.   1997.   V. 34.   P. 48-54.

5. Gordeeva, A.V. Cross-Talk between reactive oxygen species and calcium in living cells / A. V. Gordeeva [et al.]. // Biochemistry.  2003.   Vol. 68, No.10.   P. 1077-1080.

6. Ануфриев, И.Е. MATLAB 7 – СПб.: БХВ-Петербург, 2005. – 1104 с.: ил.


Приложение


Презентация к выпускной работе








скачать


Смотрите также:
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» 3ФР84 Магистрант физического факультета кафедры биофизики
299.42kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» магистрант кафедры социологии
304.23kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант Экономического факультета Орлов Юрий Анатольевич
180.37kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры технологий коммуникации Тимофеева Анна
267.28kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры археологии и специальных исторических дисциплин исторического факультета
261.28kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры функционального анализа
280.3kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры менеджмент Жданович Максим Брониславович
245.97kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры мировой экономики Бугаенко Виктория Николаевна
332.56kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры менеджмента и организации здравоохранения Шакирова Дина Закировна
200.2kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры информационного и программно-математического
161.5kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант Кафедры истории международных отношений и внешней политики
474.5kb.
Выпускная работа по «Основам информационных технологий» Магистрант кафедры психологии Дровнина Елена Геннадьевна
300.85kb.