Главная стр 1
скачать


На правах рукописи

КАРЛОВА Мария Юрьевна

РАЗРАБОТКА S- И R-БРУЦЕЛЛЁЗНЫХ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ

ДИАГНОСТИКУМОВ, ИЗУЧЕНИЕ ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник


Дегтяренко Людмила Владимировна


Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор



Храмцов Виктор Викторович,

доктор ветеринарных наук, профессор



Салмаков Константин Михайлович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Нижегородская государственная



сельскохозяйственная академия

Защита состоится « 15 » июня 2010 г. в « 11-00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» мая 2010 г.





Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева


1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Бруцеллез относят к числу опасных зооантропонозов. За последние годы в ряде регионов РФ осложнилась эпизоотическая ситуация по этой болезни (Ю.В. Пашкина, 2007; С.К. Димов с соавт., 2009; М.М. Желудков, 2009).

При бруцеллезе животных широкое практическое применение в нашей стране получили, прежде всего, реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК, РДСК), роз бенгал проба (РБП), реакция иммунодиффузии (РИД), кольцевая реакция с молоком (КР).

Несмотря на специфичность и чувствительность, эти тесты, по мнению многих исследователей, не выявляют всех инфицированных животных при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств (К.В. Шумилов, 1981; И.А. Косилов, 1999; О.Д. Скляров, 2005; М.П. Альбертян, М.И. Искандаров, А.И. Федоров, 2006; Н.М. Колычев, М.А. Бажин, В.С. Власенко, 2007 и др.).

В современных условиях происходит дальнейшее разукрупнение животноводческих хозяйств. Развиваются мелкие крестьянские и фермерские хозяйства. В этой связи целесообразно изыскание простых высокочувствительных экспресс-методов, позволяющих проводить не только диагностику бруцеллеза у интактных животных, но и дифференцировать больных от привитых слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами.

РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) при бруцеллезе была внедрена в СССР в медицинскую практику. При этом использовали лиофилизированный эритроцитарный диагностикум, выпускаемый Одесским предприятием по производству бактериальных препаратов, методика изготовления которого была разработана в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. В ветеринарии этот препарат благодаря разработкам Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ), ФГУ Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ), Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВСДВ) был принят в СССР к внедрению при бруцеллезе крупного рогатого скота в 1990 году. После распада СССР возникла необходимость разработки в РФ отечественного диагностикума, который возможно бы было применять не только на непривитых животных, но и на иммунизированных слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами. Разработку технологии изготовления S-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов осуществляли С.Г. Хаиров, О.Ю. Юсупов (1979); И.П. Иванов, В.Б. Бельченко (1980); А.П. Красиков (2002) и др., но к началу наших исследований зарегистрированного в РФ S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для ветеринарных целей не было.

О необходимости использования при дифференциальной диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в целях оценки эпизоотической ситуации и контроля качества оздоровления неблагополучных хозяйств не только S-, но и R-диагностикумов, сообщали: К.М. Салмаков, 1975, 2007; И.П. Никифоров, 1995; А.С. Донченко с соавт., 2003; В.В. Сочнев, 2004; Л.В. Дегтяренко, 2005; А.М. Фомин с соавт., 2009 и др. В частности, с этой целью применяли R-бруцеллезный антиген в РСК.

Сведения о возможности использования РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом для оценки иммунного статуса животных, вакцинированных инагглютиногенными и слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, крайне ограничены.

Исходя из вышеизложенного, считаем, что исследования, посвященные разработке S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА, являются актуальными.



Цель исследований. Цель исследования – разработка S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА, изучение их эффективности при бруцеллезе животных.

Задачи исследования:

  • разработать рациональную технологию изготовления S-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучить его эффективность в экспериментальных, производственных условиях на разных видах животных;

  • разработать рациональную технологию изготовления R-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучить его эффективность на лабораторных животных и крупном рогатом скоте.

Научная новизна. Разработаны новые биотехнологии изготовления специфичных активных и чувствительных S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов для РНГА.

В экспериментальных и производственных условиях доказана высокая диагностическая значимость новых S- и R- бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов на разных стадиях развития инфекционного и вакцинного процессов.

Доказана более высокая чувствительность сконструированного S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в сравнении с официальными методами диагностики при исследовании сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота в очагах естественного течения бруцеллезной инфекции.

Разработаны критерии эпизоотической оценки животных с разным иммунным статусом, реагирующих в РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах.

Показана возможность использования РНГА с изготовленным S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом при исследовании на бруцеллез сыворотки крови и молока у крупного рогатого скота, реиммунизированного слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов B.abortus 82, 75/79-АВ, в ранние и отдаленные сроки после прививки (с 30-го дня – молоко, с 60-го – сыворотка крови).

Впервые показана целесообразность проведения контроля иммунного ответа у животных, привитых слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ, с использованием разработанного R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА, а также применения указанного теста при дифференциально-диагностических исследованиях крупного рогатого скота на бруцеллез в комплексе с другими средствами и методами.



Практическая и теоретическая значимость работы. Внедрение в ветеринарную практику РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом позволит более эффективно контролировать эпизоотическую обстановку по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, своевременно выявлять источники возбудителя инфекции и способствовать ускорению ликвидации болезни.

Разработанный R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум в РНГА позволит контролировать иммунный ответ у крупного рогатого скота, привитого слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ, и дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, реагирующих на вакцину.

Результаты научных исследований могут быть использованы при изучении патогенеза и иммуногенеза бруцеллеза животных, инфицированных как типичными, так и диссоциированными формами бруцелл.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: второй международной конференции «Актуальные вопросы диагностики болезней животных» (Алматы, 2005), международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005), 5-й межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006), 7-й межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций» (Омск, 2009).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья – в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ («Ветеринария и кормление»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 26 таблицами, 9 рисунками. Список литературы включает 205 источников, из них 52 – зарубежных.



Внедрение результатов исследований. Результаты исследований использованы для разработки: Инструкции по применению набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), утвержденной Россельхознадзором 25.09.2006 г.; методических рекомендаций «Контроль поствакцинального иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии; методических рекомендации по дифференциальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами и по контролю иммунного ответа крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, утвержденных секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области (при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области), прот. №7 от 24.11.2006 г. и прот. №4 от 10.10.2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • результаты разработки рациональной технологии изготовления S-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучения его эффективности в экспериментальных, производственных условиях на разных видах животных;

  • результаты разработки рациональной технологии изготовления R-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучения его эффективности на лабораторных животных, крупном рогатом скоте.




  1. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования
Работа выполнена в лаборатории диагностики бруцеллеза Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных в период с 2003 по 2009 годы.

В процессе разработки и апробации эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов были исследованы сыворотки крови от 263 морских свинок, 77 кроликов. Производственные испытания новых бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов проведены в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу при обследовании 49266 гол. крупного рогатого скота, 4954 гол. овец и 3834 свиней различных половозрастных групп.

Иммунизацию, заражение подопытных животных, отбор материала для бактериологических исследований, посевы на питательные среды, типизацию выделенных культур проводили по общепринятым методикам.

Для заражения животных применяли вирулентные штаммы B.abortus 54, 99; B.suis 1330 (S-формы бруцелл); B.abortus 16-71, 68-71 (R-формы бруцелл). При вакцинации животных использовали штаммы B.abortus 82, 75/79-АВ, 19; B.melitensis Rev-1.

В качестве диагностических тестов в экспериментах и производственных опытах при исследовании сывороток крови применяли РА пробирочную, РБП, РНГА, РСК с S- и R-бруцеллезными антигенами, РИД с О-ПС антигеном; при исследовании молока – КР, РНГА с молоком, РАП (реакция агглютинации пластинчатая).

В РНГА испытывали эритроцитарные бруцеллезные диагностикумы, изготовленные по разработанным нами методикам.

Активность изготовленных S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов определяли в РНГА со стандартным образцом лиофилизированной сыворотки антибруцелла абортус ВГНКИ, стандартной бруцеллезной сывороткой производства ООО «Биоцентр»; гипериммунными S- и R-бруцеллезными кроличьими сыворотками, полученными по схеме ВНИИБТЖ. Для определения диагностических титров S- и R-бруцеллезных эритроцитарных антигенов исследовали сыворотки крови морских свинок, кроликов с разведения 1:10 и выше, непривитого крупного рогатого скота – с 1:50 и выше, свиней и овец – с 1:25 и выше.

Чувствительность экспериментальных S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов изучали в опытах на лабораторных животных, а также в неблагополучных по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота хозяйствах Омской области.

Постановку РНГА с испытуемыми S- и R-антигенами осуществляли общепринятым способом на физиологическом растворе.

В РА применяли R-бруцеллезный цветной антиген из «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл», изготовленного во ВНИИБТЖ, в РСК – R-бруцеллезный антиген ВНИИБТЖ-ВГНКИ, сконструированный фенольным способом, полученный из глубокодиссоциированного штамма В.abortus 16/4.

Математическая обработка цифровых данных отдельных экспериментов включала определение средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m) (А.Т. Усович, П.Т. Лебедев, 1970). Титры антител перевели в числовое выражение логарифмов с основанием 10.

Методики отдельных экспериментов, производственных опытов, изложены в соответствующих разделах диссертации. Часть исследований выполнена совместно с сотрудниками ВНИИБТЖ (В.Г. Ощепковым, Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницыной, С.А. Власовой, Н.Г. Шпак) и Государственного учреждения Омской области «Омской областной ветеринарной лаборатории» (И.Н. Каликиным).


2.2. Результаты исследований
2.2.1. Результаты разработки рациональной технологии изготовления

S-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучения его эффективности

в экспериментальных, производственных условиях на разных

видах животных
2.2.1.1. Отработка методики изготовления S-бруцеллезного

эритроцитарного диагностикума
При изготовлении эритроцитарного антигена использовали эритроциты барана, стабилизацию которых проводили с помощью формалина по методу R. Weinbach (1958) в нашей модификации.

Первоначально апробировали способ получения S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума по методике Прикаспийского ЗНИВИ (С.Г. Хаиров, 2002), который заключался в экстрагировании антигена из бактериальной массы штамма В.abortus 19 и обработке суспензии бруцелл 2,0 % вторичным алкилсуфатом натрия. В качестве детергента авторы применяли моющую жидкость «Прогресс», в состав которой входил ряд поверхностно-активных веществ, в том числе и вторичный алкилсульфат натрия. По данной методике было изготовлено шесть опытных серий S-эритроцитарных диагностикумов, из них три серии обладали недостаточной (титр 1:400-1:800) активностью при постановке РНГА с S-биофабричной бруцеллезной сывороткой (заданный титр 1:1600).

В этой связи было продолжено изыскание рационального способа изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума.

При изготовлении S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума использовали культуру вакцинного штамма В.abortus 19. Антигенное начало извлекали химическим методом, воздействуя на клетки бруцелл поверхностно-анионоактивным веществом из группы первичных алкилсульфатов – додецилсульфатом натрия. В процессе изыскания S-бруцеллезного эритроцитарного антигена были апробированы различные параметры времени, температуры, а также концентрации додецилсульфата натрия. Оптимальная доза антигена, изготовленного по разработанному способу, для сенсибилизации опытных серий эритроцитов стабильно составляла 0,25–0,5 мл.

Разработанным нами способом было изготовлено 14 серий S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума.

При проверке сроков годности антигены испытывали на специфичность с негативными сыворотками крупного рогатого скота и активность с агглютинирующей бруцеллезной сывороткой ООО «Биоцентр». Эритроцитарные диагностикумы, изготовленные по разработанной методике, сохраняли активность и специфичность в течение двух лет (срок наблюдения) с условием хранения их при температуре 2 – 6 С.

Кроме того, провели изыскание оптимальной среды высушивания при лиофилизации S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. При этом выяснили, что хорошей растворимостью в физиологическом растворе, специфичностью, активностью обладали бруцеллезные эритроцитарные диагностикумы, при высушивании которых применяли сахарозо-желатиновую среду (Б.И Бланков, Д.Л. Клебанов, 1961).
2.2.1.2. Изучение диагностической ценности РНГА в опытах на

лабораторных животных, сенсибилизированных разными

штаммами бруцелл
В опыте на 12 кроликах провели сравнительное изучение чувствительности антигенов для РНГА, изготовленных из гомологичных штаммов (B.abortus 19, B.abortus 54, B.suis 1330), которые применяли для заражения и вакцинации животных.

При этом было установлено, что уже на седьмые сутки после вакцинации культурой штамма B.abortus 19 и заражения культурами вирулентных штаммов B.abortus 54, B.suis 1330 в организме 100,0 % кроликов происходит биосинтез специфических бруцеллезных антител, которые регистрируются в РНГА со всеми опытными диагностикумами, а также в РА и РБП. В РНГА испытуемые антигены имели высокую активность. Более высокой активностью обладал антиген, изготовленный из культуры вирулентного штамма B.abortus 54. Уровень гемагглютининов у отдельных кроликов достигал 1:40920.

Таким образом, чувствительность РНГА не зависела от видовых особенностей культур бруцелл, используемых при изготовлении диагностикума. Однако более высокую активность определили у антигена, эритроциты которого нагружали сенситином, извлеченным из вирулентного штамма B.abortus 54. Иными словами, активность антигена, изготовленного разработанным способом, зависит от вирулентных свойств штаммов бруцелл.

Изучение чувствительности РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном продолжили при исследовании сывороток крови от 177 морских свинок в трех опытах.

Испытание диагностической ценности РНГА в сравнении с РА, РСК, РБП при сенсибилизации 64 морских свинок бруцеллами видов abortus, suis в опыте № 1 показало, что РНГА имеет высокую чувствительность, так как с её помощью на 30 сутки после заражения и вакцинации установлено 100,0 % животных, положительно реагирующих даже на малые дозы бруцелл (100 м.к.).

В опыте № 2 при исследовании сыворотки крови от 68 морских свинок в отдаленные сроки (150-420 суток) после заражения вирулентным штаммом бруцелл B.abortus 54 (1000 м.к.) чувствительность РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном была высокой: положительно реагировали 95,1-100,0 % морских свинок.

При исследовании животных из опыта № 3, зараженных вирулентными культурами B.suis 1330, B.abortus 54 и вакцинированных В.melitensis Rev-1 в дозах 100 и 1000 м.к., установили, что гемагглютинины у значительного количества опытных животных обнаруживаются, в отличие от агглютининов, позже, к 21 суткам исследования. При этом только в группе животных, вакцинированных В.melitensis Rev-1 малыми дозами (100 м.к.), положительно реагировало 75,0 %, в остальных – 100,0 % морских свинок. РНГА имела стабильные показатели с 30 по 60 сутки исследований животных, когда позитивные результаты имели 100,0 % вакцинированных или зараженных морских свинок, при этом у отдельных животных титр в РНГА достигал 1:20480.

Таким образом, чувствительность РНГА с испытуемым антигеном зависит от стадии развития бруцеллезной инфекции, от биологических свойств штамма (вирулентности) и дозы инфицирующего агента.


2.2.1.3. Результаты испытания РНГА с S-бруцеллезным

эритроцитарным диагностикумом в производственных условиях
2.2.1.3.1. Результаты изучения специфичности S-бруцеллезного

эритроцитарного диагностикума
Специфичность изготовленных нами опытных партий эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов изучали при исследовании непривитых животных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах Омской области.

При этом обследовали 16248 проб сыворотки крови крупного рогатого скота, неиммунизированного противобруцеллёзными вакцинами, из шести хозяйств. Специфичность эритроцитарного бруцеллезного антигена изучали также на других видах животных: 3834 гол. свиней разных половозрастных групп из девяти свиноводческих хозяйств, 4474 гол. овец из трех хозяйств.

Результаты исследований сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота, свиней, непривитых противобруцеллезными вакцинами, показали, что диагностическим титром РНГА при исследовании крупного рогатого скота целесообразно считать титр 1:100, свиней – 1:50, мелкого рогатого скота – 1:25.
2.2.1.3.2. Результаты изучения чувствительности РНГА с

S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом
Изучение диагностической значимости РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном проведено при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, принадлежащего частному сектору с. Чадск Щербакульского района и ОПХ «Боевое» Исилькульского района Омской области (табл. 1).
Таблица 1 – Результаты исследования сыворотки крови от непривитого противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу стад


№ экспертизы

Количество проб

Реагировали положительно


Совпали показатели РА+РСК с РНГА

Дополнительно выявили в РНГА к комплексу РА+РСК+РБП+

РИД


РА+ РСК

РНГА

абс.

%

абс.

%

абс.

%

абс.

%

Э 12

70

12

17,1

15

21,4

12

100,0

3

4,3

Э 33

53

-

-

3

5,7

-

-

1

1,9

Э 45

53

1

1,9

3

5,7

1

100,0

2

3,8

Э 53

48

1

2,1

2

4,2

1

100,0

1

2,1

Э 38

48

1

2,1

1

2,1

1

100,0

-

-

Э 7

57

20

35,1

21

36,8

19

95,0

2

3,5

Э 7А

132

32

24,2

31

23,5

31

96,9

-

-

Э 9

137

12

8,8

25

18,2

10

83,3

7

5,1

Итого

598

79

13,2

101

16,9

75

94,9

16

2,7

При исследовании 598 гол. крупного рогатого скота, непривитого противобруцеллезными вакцинами, неблагополучных по бруцеллезу стад комплексом РА+РСК было установлено 79 больных бруцеллезом животных (13,2 %). Более высокая чувствительность отмечена у РНГА с испытуемым S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном. С её помощью удалось выявить максимальное количество положительно реагирующих – 101 (16,9 %). Дополнительно с помощью РНГА к комплексу РА+РСК+РБП+РИД было выделено в разных хозяйствах от 1,9 до 5,3 % положительно реагирующих животных. При этом отмечена высокая степень совпадения положительных результатов РНГА и комплекса РА+РСК+РБП+РИД (83,3–100,0 %). Ценные данные в отношении диагностической эффективности РНГА с испытуемым S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом получены нами при обследовании мелкого рогатого скота трех неблагополучных по бруцеллезу отар в трех районах Омской области. Установлено диагностическое преимущество РНГА перед комплексом РА+РСК+ РБП+РИД (выделено соответственно 36,9 % и 24,2 % положительно реагирующих).

Из общего количества исследованных проб сыворотки крови (480) с помощью РА+РБП+РСК+РИД диагностировали 120 положительных проб (25,0 %), из них положительные результаты в РСК отмечены в 114 пробах (23,8 %). В РНГА реагировало положительно 177 гол. (36,9 %). Только с помощью этого теста из общего количества животных удалось выявить 57 (11,9 %) реагирующих животных. Дополнительно с помощью S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА к комплексу РА+РБП+РСК+РИД диагностировали в отдельных отарах от 8,7 до 16,0 % реагирующих животных.
2.2.1.3.3. Результаты испытания РНГА с S-бруцеллезным

эритроцитарным диагностикумом при исследовании животных,

привитых вакцинами из штаммов 82, 75/79 АВ
Далее изучали возможность применения РНГА с новым бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, реиммунизированного вакцинами из штаммов B.abortus 82, 75/79-АВ.

При обследовании 20855 гол. крупного рогатого скота, ревакцинированного штаммом 82, из благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области предварительно определяли диагностический титр РНГА, сроки исследования животных после иммунизации. При этом установлено, что исследование сыворотки крови крупного рогатого скота в РНГА с разведения 1:200 можно проводить через 60 суток и более после иммунизации вакциной из штамма B.abortus 82, т.к. гемагглютинины в титре 1:200 диагностировали в этот срок у низкого процента животных (0,1 %).

Изучение диагностической эффективности РНГА было продолжено при обследовании крупного рогатого скота, привитого вакцинами из штаммов 82 и 75/79-АВ, в пяти неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах Омской области.

При исследовании 7097 проб сыворотки крови выделено 188 (2,6 %) больных бруцеллезом животных. У 274 (3,9 %) гол. серопозитивные реакции отнесены к поствакцинальным. Животные с поствакцинальными реакциями были оставлены в стадах, чем предотвращен дополнительный экономический ущерб при оздоровлении хозяйств. Комплексом РА+РСК диагностировали максимальное количество положительно реагирующих – 436 (6,1 %), однако в высоких титрах реагировало только 139 (2,0 %) животных. В РНГА установили 279 положительных проб (3,9 %), из них 167 (2,4 %) – в титре 1:400 и выше (максимальный титр 1:6400). Все животные с титром гемагглютининов 1:400 и выше были признаны больными бруцеллезом. Достоверность данных РНГА подтверждается совпадением её показаний с комплексом РА+РСК в высоких титрах. Так, из общего количества реагирующих в высоком титре РНГА (167 гол.) в 124 случаях (74,2 %) в сыворотках крови животных были определены S-агглютинины и комплементсвязывающие антитела в высоких концентрациях. Дополнительно с помощью РНГА удалось диагностировать 28 положительно реагирующих животных.

Следующий этап нашей работы был посвящен изучению возможности применения РНГА с молоком при бруцеллезе крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82.

При исследовании 641 пробы молока с испытуемым S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном от животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств через 30-60 суток после иммунизации вакциной из штамма 82 положительный результат в разведении 1:50 диагностировали только у одной коровы (0,2 %), что свидетельствует о специфичности реакции. Результаты КР с молоком, в т.ч. с цельным, а также РАП были отрицательные.

Таким образом, мы установили, что исследование молока в РНГА с новым бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом можно проводить в ранние сроки (через 30 суток) после иммунизации животных. Диагностическим титром реакции при исследовании молока от коров этой категории хозяйств целесообразно считать разведение молока 1:100, в котором произошла гемагглютинация эритроцитов с оценкой на 3 и 4 креста.

При исследовании молока в РНГА от 1643 коров, иммунизированных вакциной из штамма 82, из двух неблагополучных по бруцеллезу гуртов выявили более высокую чувствительность испытуемого S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в сравнении с КР, т.к. в сроки 1–6 месяцев после вакцинации животных в РНГА положительно реагировало 2,4 % коров, в КР–1,9 %. Достоверность показаний РНГА с молоком подтверждают результаты исследования сыворотки крови от этих животных. Так, 68,0 % коров, реагировавших в РНГА, одновременно имели бруцеллезные антитела, выявленные комплексом РА+РСК+РНГА+РИД.


2.2.1.3.4. Изучение эпизоотической опасности животных, положительно реагирующих в РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом
При изучении вопроса об эпизоотической опасности животных, имеющих позитивные показатели в РНГА, было отобрано восемь коров с различным сочетанием иммунологических реакций, молоком которых инфицировали морских свинок (табл. 2).

Положительный результат биопробы на морских свинках получен у четырех коров (50,0 %), в т.ч. из патологического материала морских свинок были выделены культуры бруцелл.

В результате изучения биологических свойств изолированных от животных культур установлено, что они имели признаки полевых штаммов бруцелл.

Следует отметить, что животные, от которых были выделены культуры, положительно реагировали в РНГА с сывороткой крови в титрах 1:200-1:3200, РНГА с молоком – 1:100-1:800.

Кроме того, молоко от пяти коров, которые реагировали в РНГА с сывороткой крови в титрах 1:100-1:800 и молоком 1:50-1:800, было исследовано методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) в ГУ «ООВЛ». При этом генетический материал микроорганизмов рода Brucella был обнаружен в пяти представленных образцах, что подтверждает достоверность результатов РНГА и доказывает эпизоотическую опасность животных, положительно реагирующих с испытуемым S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном.

Таблица 2 – Результаты иммунологических, бактериологических и молекулярно-биологических исследований коров, реагировавших положительно в РНГА




п/п


Район, хозяйство,

ферма,


№ экспертизы

Результаты исследования сыворотки

крови


Результаты

исследования молока


Результаты биопробы

на морских свинках



Выделена культура из биологического

объекта


Результат исследования молока ПЦР

РА

(МЕ)


РСК

РНГА

КР

РНГА

РАП

РА

(МЕ)


выде

лена


культура

1

2



Колосовский р-н,

ф. Кутурлы

корова, экс. 43

корова, экс. 43



50

40



1:5


1:40

1:200


1:1600

цел.


1:4

1:100


1:400

+

+



20

20



+

+



н/и


н/и

н/и


н/и

3


Омский р-н, ЗАО «Племзавод Омский»

корова № 2027, экс.48


100

1:20

1:3200

1:8

1:800

+

40

+

+

н/и


4

5



6

7

8



Щербакульский р-н, с. Чадск экс. 18а

корова №1

корова №2

корова №3

корова №4

корова №5



-

50



-

100


-

1:20


1:10

1:10


1:80

1:10


1:800


1:800

1:100


1:800

-


1:2


-

-

1:8



-

1:100


1:50

-

1:800



1:50

+

+



-+

-


-

-



-

20

-



-

-



-

+

-



-

-



н/и

+

н/и



+

+



+

+

+



Примечание: н/и – исследования не проводили
Эпизоотическая опасность коров, реагирующих в РНГА с новым S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом, доказана при бактериологическом исследовании молока: у животных, из биологического материала которых были выделены культуры полевых штаммов бруцелл, РНГА с сывороткой крови и молоком была положительной в 100,0 % случаев.

2.2.2. Результаты разработки рациональной технологии изготовления

R-бруцеллезного диагностикума для РНГА и изучение его эффективности на лабораторных животных, крупном рогатом скоте

2.2.2.1. Изыскание способа изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена, изучение его активности и специфичности
Для выявления R-бруцеллезных антител в сыворотке крови животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл, сконструировали R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум из глубокодиссоциированного штамма В.abortus 16/4 по разработанной нами методике, отличающейся от биотехнологии изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного антигена концентрацией первичного алкилсульфата натрия и другими параметрами.

При определении активности изготовленной опытной партии R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума установили, что гемагглютинины в сыворотке крови кроликов, сенсибилизированных R-формой бруцелл по схеме ВНИИБТЖ, содержались в титре от 1:1280 до 1:2560.

Специфичность изготовленных серий R-бруцеллезных эритроцитарных антигенов была установлена при постановке РНГА с сыворотками крови от здоровых животных – 20 кроликов, 26 морских свинок и 505 гол. непривитого противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота из двух благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области. При этом получены отрицательные результаты исследований кроликов и морских свинок в разведениях сыворотки крови 1:10, а крупного рогатого скота – 1:50 как с единым антигеном в РА, РСК, так и с новым испытуемым R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом для РНГА.

Специфичность R-бруцеллезного эритроцитарного антигена была также подтверждена при исследовании сыворотки крови 10 кроликов, гипериммунизированных вакцинным штаммом B.abortus 104 М (S-форма), 8 морских свинок, вакцинированных штаммом B.melitensis Rev-1 (S-форма). При этом во всех пробах были получены отрицательные результаты РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом в разведении сыворотки крови 1:10 и выше.


2.2.2.2. Определение чувствительности R-бруцеллезного

эритроцитарного антигена в опыте на морских свинках
Чувствительность R-бруцеллезного эритроцитарного антигена испытывали при исследовании сыворотки крови от 60 морских свинок, которые были иммунизированы или инфицированы подкожно в дозе 1 млрд м.к. RS- (B.abortus 82, B.abortus 75/79-АВ), R-формами бруцелл (B.abortus 16-71, B.abortus 68-71).

Установлено, что биосинтез R-антител в организме животных с помощью РСК можно обнаружить у 58,3-76,9 % животных, сенсибилизированных RS- и R-формами бруцелл, через 15 суток после инокуляции антигенов. Гемагглютинины в сыворотки крови морских свинок, иммунизированных или зараженных RS- и R-формами бруцелл, установили на 30 сутки исследования у 20,0-54,5 % животных, на 60 сутки – у 66,7-100,0 % животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл.

В группах морских свинок, вакцинированных слабоагглютиногенными штаммами B.abortus 75/79-AB и 82, во все сроки исследований диагностировали S- и R-комплементсвязывающие антитела.

Чувствительность РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным антигеном почти во всех случаях, за исключением морских свинок, вакцинированных штаммом 82, при исследовании животных была ниже в сравнении с РСК с R-бруцеллезным диагностикумом.


2.2.2.3. Изучение диагностической ценности R-бруцеллезного

эритроцитарного диагностикума при исследовании крупного рогатого

скота, иммунизированного вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ

в производственных условиях
Изучение диагностической эффективности опытного R-бруцеллёзного антигена для РНГА в сравнении с R-бруцеллезным антигеном для РСК провели в благополучных по бруцеллёзу стадах крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ.

РНГА оказалась менее чувствительной при изучении биосинтеза R-бруцеллезных антител в организме животных в сравнении с РСК с R-антигеном. С помощью R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума на протяжении 60 суток удалось обнаружить от 54,0 до 86,4 % реагирующих животных (в титре от 1:50 до 1:400). В РСК с R-антигеном реагировало 98,0-100,0 % гол крупного рогатого скота. В более отдаленные сроки исследования животных (120-360 суток) биосинтез R-гемагглютининов в организме крупного рогатого скота значительно снижался (30,1-15,2 % реагирующих), как и R-комплементсвязывающих антител, которые к 360 суткам обнаруживали у 22,0 % животных.

При обследовании молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, в отдельных хозяйствах количество реагирующих с R-антигенами в РСК через 30 суток после вакцинации колебалось от 37,8 % до 100,0 %, в РНГА – от 29,7 % до 84,6 %, что доказывает целесообразность осуществления контроля поствакцинального иммунного ответа.

Важно отметить, что, несмотря на более низкую чувствительность РНГА в сравнении с РСК, с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена РНГА диагностировано дополнительно к РСК с R-антигеном 3,6 % положительно реагирующего крупного рогатого скота, что свидетельствует о целесообразности применения, наряду с РСК, и РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным антигеном с целью диагностики R-бруцеллезных антител у животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл.

Изучение диагностической ценности РНГА с R-бруцеллезным антигеном продолжили при исследовании 1514 гол. крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, на неблагополучной по бруцеллезу ферме Омской области.

В результате дифференциации реакций на протяжении четырех месяцев исследования сыворотки крови крупного рогатого скота выявлено 54 (3,6 %) больных бруцеллезом животных и 70 (4,6 %) гол. с поствакцинальными реакциями. В РНГА и РСК R-бруцеллезные антитела в сыворотке крови больного бруцеллезом крупного рогатого скота определяли соответственно у 47 (87,0 %) и 44 (81,5 %) гол. С испытуемым R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом в отдельные сроки исследования положительно реагировало 100,0 % животных, что свидетельствует о высокой чувствительности антигена.

При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота с поствакцинальными реакциями показатели РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным антигеном уступали РСК с R-антигеном (соответственно, 80,0 % и 97,1 % положительно реагирующих животных). Однако с помощью РНГА в отдельные сроки исследования статус здоровых удалось подтвердить у всех животных, реагирующих в низких титрах в РА и РСК с единым антигеном.

Таким образом, в экспериментальных и производственных условиях установлено, что диагностическая ценность РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным антигеном ниже в сравнении с РСК с R-антигеном ВНИИБТЖ, но в отдельные сроки исследования она была равнозначной и позволяла дополнительно диагностировать животных с R-бруцеллезными антителами.




  1. ВЫВОДЫ




  1. Разработанная биотехнология изготовления S-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА, основанная на химическом воздействии первичного алкилсульфата натрия на культуру вакцинного штамма B.abortus 19, позволяет получить активный специфичный и экономичный диагностикум.

  2. Чувствительность РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным антигеном не зависит от видовых особенностей культур бруцелл, используемых при изготовлении диагностикума. Активность антигена зависит от вирулентных свойств штаммов бруцелл, при изготовлении его из вирулентных штаммов бруцелл, в сравнении с вакцинным штаммом, в отдельные сроки исследований она выше в два раза.

  3. Лиофильное высушивание S-бруцеллезного эритроцитарного антигена с применением сахарозо-желатиновой среды позволяет получить специфичный активный антиген, не уступающий в чувствительности нативному препарату.

  4. РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом обладает высокой чувствительностью: в опытах на морских свинках позволяет диагностировать в отдельные сроки исследования до 100,0 %  сенсибилизированных бруцеллезными антигенами животных.

В естественных очагах бруцеллеза крупного рогатого скота РНГА выявляет дополнительно к комплексу официальных диагностических тестов до 5,3 % реагирующих животных при высоком проценте совпадений с РА, РСК, РИД, РБП (от 83,3 до 100,0 %).

При бруцеллезной инфекции у мелкого рогатого скота РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом выявляет дополнительно к показаниям официальных тестов до 12,7 % реагирующих животных при 100,0 % совпадении её показателей с позитивными показаниями РА, РСК, РБП и РИД.

Животные, имеющие в сыворотке крови и молоке S-гемагглютинины в диагностическом титре, представляют эпизоотическую опасность, что установлено при бактериологических и молекулярно-биологических исследованиях.


  1. Исследование сыворотки крови в РНГА с S-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом можно проводить у крупного рогатого скота через 2 месяца, а молока через 30 суток и последующие сроки после иммунизации вакцинами из штаммов B.abortus 82 и 75/79-АВ при осуществлении эпизоотического контроля благополучия животных и оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу пунктов.

  2. R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум, сконструированный при воздействии на микробные клетки глубокодиссоциированного штамма Bbortus 16/4 первичного алкилсульфата натрия, обладает специфичностью и чувствительностью. При экспериментальном инфицировании морских свинок диссоциированными штаммами бруцелл с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена в РНГА возможно выявить до 100,0 % зараженных животных.

  3. РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом позволяет наиболее эффективно осуществлять контроль иммунного ответа у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в ранние сроки после иммунизации (1-2 месяца), наряду с РСК c R-бруцеллезным антигеном. При проведении дифференциально-диагностических исследований крупного рогатого скота, привитого вакцинами из штаммов 82 и 75/79-АВ, РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным антигеном диагностирует дополнительно к РСК с R-бруцеллезным антигеном от 1,7 до 10,0 % животных с наличием в сыворотке крови поствакцинальных антител.




  1. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Технологии изготовления S- и R-бруцеллезных эритроцитарных антигенов целесообразно использовать в биологической промышленности при производстве диагностических препаратов.



Результаты разработки рациональных схем применения РНГА с новыми S- и R-бруцеллезными эритроцитарными диагностикумами в системах диагностики бруцеллеза животных (в том числе дифференциальной), а также контроля иммунного ответа у крупного рогатого скота, привитого слабоагглютиногенными вакцинами, вошедшие в соответствующие инструкцию и рекомендации, необходимо учитывать практическим ветеринарным специалистам и научным сотрудникам при решении проблемы диагностики и специфической профилактики бруцеллеза животных, а также использовать в учебном процессе ветеринарных ВУЗов, учреждениях повышения квалификации ветеринарных врачей.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Карлова, М.Ю. Разработка S- и R-бруцеллезных эритроцитарных диагностикумов, испытание их при бруцеллезе крупного рогатого скота / М.Ю. Карлова, Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 4. – С.4-5.

  2. Дегтяренко, Л.В. Новый экспресс-метод диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота / Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, С.А. Власова, М.Ю. Борисова // Актуальные вопросы диагностики болезней животных: матер. 2-й междунар. конф. – Алматы, 2005. – С. 233-235.

  3. Дегтяренко, Л.В. Результаты производственного испытания реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе крупного рогатого скота / Л.В. Дегтяренко, В.Г. Ощепков, Г.В. Разницына, С.А.Власова, М.Ю. Борисова // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: матер. междунар. симпозиума. – Казань, 2005. – Ч.2. – С. 121-125.

  4. Разницына, Г.В. Сравнительная оценка диагностической ценности серологических тестов при сенсибилизации морских свинок бруцеллами / Г.В. Разницына, Л.В. Дегтяренко, М.Ю. Карлова // Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных: сб. науч. тр. – Омск, 2006. – С. 189-194.

  5. Дегтяренко, Л.В Испытание R-бруцеллезных антигенов в экспериментальных условиях / Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, Н.Г. Шпак, И.Н. Каликин, М.Ю. Карлова // Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала: матер. межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 180-летию аграрной науки Сибири. – Омск, ВНИИБТЖ, 2008. – С. 111-117.

  6. Дегтяренко, Л.В. Диагностическая ценность реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе крупного рогатого скота / Л.В. Дегтяренко, В.Г. Ощепков, Г.В. Разницына, М.Ю. Карлова // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: матер. Всероссийской науч.-практ. конф. – Омск, ВНИИБТЖ, 2009. – С. 44-47.

  7. Карлова, М.Ю. Испытание R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе крупного рогатого скота / М.Ю. Карлова, Л.В. Дегтяренко // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: матер. Всероссийской науч.-практ. конф. – Омск, ВНИИБТЖ, 2009. – С. 62-66.

  8. Ощепков, В.Г. Эффективность применения РНГА для оценки крупного рогатого скота при бруцеллезе / В.Г. Ощепков, Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, М.Ю. Карлова // Матер. междунар. конф., посвящ. 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. – Самара, 2009. – С. 316-319.


скачать


Смотрите также:
Разработка s- и r-бруцеллёзных эритроцитарных диагностикумов, изучение их эффективности при бруцеллезе животных 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
341.63kb.
Разработка новых методов генодиагностики болезни марека и определение их роли в системе противоэпизоотических мероприятий 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
322.73kb.
Применение озона в бактериологической диагностике туберкулеза 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
352.56kb.
Фенотипические свойства и эпизоотологическая значимость e. Coli o157: H7 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.94kb.
УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
389.72kb.
Экспериментальная модель гриппа а/H5N1 на представителях вида кошка домашняя 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 06. 02
262.18kb.
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.59kb.
Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
304.73kb.
Влияние биологически активных веществ на иммунный статус норок при алеутской болезни и иммунодефицитных состояниях 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
285.95kb.
Комплексная сравнительная оценка эпизоотич еской ситуации туберкулеза животных и методов его диагностики в сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
299.94kb.
Лечебно-профилактическая эффективность витартила и йодантипирина при респираторных болезнях телят вирусно-бактериальной этиологии 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
312.01kb.
Критерии оценки эпизоотической ситуации и прогнозирование заболеваемости крупного рогатого скота некробактериозом на основе искусственных нейронных сетей 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
359.83kb.