Главная стр 1
скачать


На правах рукописи

ОНИЩЕНКО ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ E. COLI O157:H7

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология


Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Новосибирск – 2008

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Шкиль Николай Алексеевич
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Ковальчук Наталья Михайловна,
кандидат ветеринарных наук

Вольф Виктор Теодорович
Ведущая организация: Институт ветеринарной медицины

Омского государственного аграрного

университета

Защита состоится « 29 » мая 2008 г. в ____ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский р-н, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» __________ 2008 г.





Ученый секретарь

диссертационного совета Стеблева Г.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Болезни желудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты, гастроэнтероколиты), вызываемые токсинами эшерихий, распространены повсеместно и поражают сельскохозяйственных животных различных видов, и составляют одну из сложных проблем для современной ветеринарии. В последние годы во многих развитых странах колибактериоз находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских специалистов, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека и животных стали играть эшерихии, вырабатывающие Шига-подобные токсины (веротоксины), в том числе и E. coli О157:H7 (A.В. Куликовский, А.Н. Панин, 1997). Данный серотип кишечной палочки приводит к возникновению у людей геморрагического колита, который может осложниться гемолитико-уремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП), а у молодняка крупного рогатого скота - диарею с признаками геморрагического гастроэнтерита и отечную болезнь свиней (Ю.Г. Степашин, Э.А. Светоч и др., 2005).

Несмотря на достаточно широкое изучение E. coli О157:H7 в медицине, в ветеринарии проведены отдельные исследования по выявлению частоты выделения и бактерионосительства данного микроорганизма среди различных видов животных, птицы и человека. При этом недостаточно данных о патогенных свойствах E. coli О157:H7 и резистентности к антибактериальным препаратам. В России отсутствуют данные о носительстве E. coli O157:H7 среди мелких домашних животных.

Также в ветеринарии не разработана бактериологическая методика выделения и идентификации E. coli О157:H7 из биологического материала.

В связи с этим возникает необходимость изыскания новых подходов профилактики инфекций, вызванных E. coli О157:H7, и борьбе с ней, для этого требуется комплексный подход к изучению широкого спектра биологических свойств возбудителя и совершенствование бактериологического метода выделения и идентификации E. coli О157:H7.



Цель работы – изучить фенотипические свойства и эпизоотологическую значимость E. coli О157:H7.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:



  1. Определить частоту выделения E. coli О157:H7 из различных экологических ниш.

  2. Изучить биологические свойства изолятов E. coli О157:H7.

  3. Изучить биохимические свойства и их вариабельность.

  4. В экспериментальных условиях изучить эпизоотическую значимость носительства E. coli О157:H7 у мелких домашних животных.

Научная новизна.

Получены данные о частоте выделения E. coli О157:H7 из различных экологических ниш.

Впервые на территории России установлена эпизоотологическая значимость бактерионосительства у собак и кошек.

Получены данные о восприимчивости мелких домашних животных к E. coli O157:H7.

Установлена вариабельность биохимических свойств выделенных изолятов, свидетельствующая о генетической разнородности популяции E. coli O157:H7.

Практическая ценность работы.

Усовершенствована методика выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа O157:H7 из биологического материала от животных.

Оформлена заявка на патент «Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27.11.2006.

Получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г. Экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2.0».

Подготовлены методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №3 от 30 октября 2007 г.).

Апробация работы. Материалы исследований доложены на заседаниях ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ (2004-2007 гг.), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2005 г.), на международной научно-практической конференции (Барнаул, 2005 г.), на VI Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2006 г.), на второй Международной научно-практической конференции молодых ученых (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической конференции (Москва, 2006 г.), на международной конференции (Ульяновск, 2006 г.), на третьей Российской научно-практической конференции с международным участием (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической конференции (Новосибирск, 2006 г.), на VIII Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 работы в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ (Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, и Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук)

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 124 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 201 источников, в т.ч. 140 – зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

– усовершенствование методики выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки О157:H7 из биологического материала;

– результаты исследований по частоте выделения E. coli О157:H7 из различных экологических ниш;

– биологическая характеристика изолятов E. coli О157:H7, выделенных от различных видов животных и человека;

– эпизоотическая значимость носительства E. coli О157:H7 у мелких домашних животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Диссертационная работа выполнена в 2004-2008 гг. в лаборатории болезней молодняка сельскохозяйственных животных Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, в хозяйствах Новосибирской области и Алтайского края, в ветеринарных клиниках г. Новосибирска, а также в детской инфекционной больнице Новосибирской области.

Выделение чистой культуры E. coli О157:Н7 из биологического материала (кал, молоко) проводилось в соответствии с "Методами выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli О157:Н7" (методические указания МУК 4,2,992-00). Однако в процессе выполнения данной работы методика выделения E. coli О157:H7 была модифицирована, для идентификации данных микроорганизмов из биологического материала от сельскохозяйственных и мелких домашних животных.

Для выделения чистой культуры E. coli О157:H7 использовалась селективная среда Эндо, элективная среда – сорбитол-агар и SDS-бульон.

Изучение морфологических и ферментативных свойств, чувствительности к антибактериальным препаратам, а также определение патогенности выделенных культур E. coli O157:H7 проводилось согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» утвержденных Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации от 27.07.2000 года.

В целях изучения частоты выделения E. coli O157:H7 от сельскохозяйственных, мелких домашних животных, пушных зверей и птиц было отобрано 1246 проб биологического материала и 359 проб кала от людей, в том числе 306 проб кала от детей с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции и 53 пробы от клинически здоровых взрослых людей.

Из выделенных культур E. coli O157:H7 готовились мазки и окрашивались по Граму. Подвижность данных культур исследовалась в препарате «раздавленная капля».

Серологическая идентификация энтеропатогенных изолятов E. coli определялась при помощи реакции агглютинации (РА) на стекле с агглютинирующей сывороткой к адгезивным антигенам эшерихий О157.

Для определения патогенных свойств изолятов E. coli O157:H7, использовались 264 беспородные белые мыши весом 10-15 грамм. Для этого культуры выращивали на МПА при температуре 37 °C в течение 18-20 часов, смывали стерильным физиологическим раствором и доводили до концентрации 1 млрд. КОЕ/мл. по стандарту мутности. Белых мышей заражали внутрибрюшинно, вводя каждой по 0,5 мл. (500 млн. КОЕ) взвеси бактерий. Учет результатов проводили в течение семи дней.

Для изучения эпизоотической значимости носительства E. coli O157:H7 у мелких домашних животных использовали 18 щенков и 18 котят в возрасте двух месяцев, из которых по признаку аналогов сформировали 12 групп по 3 головы в каждой.

Каждой опытной группе животных в различных дозах однократно, орально вводились патогенные культуры E. coli O157:H7, изолированные от крупного рогатого скота и собак. Через 21 день у всех животных брали кал для исследования на наличие E. coli O157:H7. Клинический осмотр опытных животных проводили по общепринятой схеме. Учитывали частоту, консистенцию и объем испражнений.

Определение чувствительности 12 изолятов E. coli O157:H7 к антибактериальным препаратам проводилось методом диффузии в агаре при помощи стандартных бумажных дисков в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных».

Чувствительность к антибактериальным препаратам 31 изолята E. coli O157:H7, определялась методом серийных разведений на микропланшетах с внесенными в лунки антибактериальными препаратами. В дальнейшем в лунки вносилось по 0,2 мл. мясопептонного бульона со взвесью изолятов. Через 24 часа инкубации при температуре 37°С, сравнивалась оптическая плотность среды в лунках с антибактериальными препаратами с контрольной лункой без них.

В опыте были использованы следующие антимикробные препараты: амикацин, амоксициллин, ампициллин, апрамицин, бензилпенициллин, гентамицин, дитрим, доксициклин, зинаприм, канамицин, квинабик, клиндамицин, коливет, левомицетин, левофлоксацин, леномак, неомицин, нифулин, нетилмицин, норфлоксацин, оксациллин, офлоксацин, пенбекс, полимиксин, рифан, родотиум, стрептомицин, тилозин, тетрациклин, ципрофлоксацин, цефазолин, цефотаксим, фуразолидон, фурадонин, энроколи, энрофлоксацин, эриромицин.

Для биохимического типирования кишечной палочки серотипа О157:H7 использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии (ПБДЭ) производства ООО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Дополнительно изучались протеолитические свойства на мясопептонном желатине (МПЖ). Изучение способности изолятов к образованию ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) проводилось на среде Кларка.

Для идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам совместно с СибФТИ была разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0». Полученные данные кодировались и после проверки соответствия кодов виду Е.coli, коды имеющихся изолятов, использовались для кластерного анализа.

Расчеты производились с помощью программы «Microsoft Excel», входящей в пакет программ «Microsoft Office 7.0». В качестве ПЭВМ использовался компьютер Pentium-4 / 48 mb/ 1.1 Gb/ 256 mb video/ Windows-XP.

Выражаем благодарность за оказание помощи в проведении исследований М.Н. Шадриной, В.Н. Афонюшкину и В.Ю. Коптеву.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Усовершенствование методики выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 из биологического материала от сельскохозяйственных и мелких домашних животных

Для выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 применялся метод, утвержденный Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (2001).

Сущность метода заключается в использовании особенностей биохимических свойств E. coli серотипа O157:H7 ферментировать сорбитол, при этом первоначальный посев производится на дифференциальную среду сорбитол-агар.

Основным недостаткам данного метода, затрудняющим его применение в ветеринарии, является различие микробного состава кишечника животных и человека, что не позволяет в качестве первичной среды использовать сорбитол агар.

По результатам проведенных нами исследований, кал людей в 27,7 раз меньше контаминирован микроорганизмами рода Proteus, чем кал животных. Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост E. coli O157:H7, что препятствует ее выделению из биологического материала и снижает информативность методики утвержденной Федеральным центром Госсанэпиднадзора. Поэтому, для исключения контаминации среды роящимися формами микроорганизмов рода Proteus, биологический материал предварительно вносили в чашку Петри со средой Эндо.

Для выделения E. coli O157:H7 в лабораторию доставляли фекалии от здоровых и больных желудочно-кишечными болезнями животных и птиц, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.



Последовательность исследования материала.

Выделение и идентификацию энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 проводили в соответствии с прилагаемой ниже схемой (рис. 1).



Первый день – каждую пробу фекалий (не более 0,5 г), взятую дротом, помещали в отдельную пробирку, содержащую 3-5 мл стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивали стеклянной палочкой и выдерживали 10-15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадачную жидкость в количестве 1-2 капли равномерно распределяли стерильным шпателем по поверхности среды Эндо в чашке Петри и инкубировали в термостате при температуре 371C в течение 18-24 часов. Данная среда обеспечивала рост только Грам (-) микрофлоры.

Второй день – чашки с культурами на агаре Эндо просматривали и отбирали 10 типичных для эшерихий колоний: круглые с гладкой, выпуклой поверхностью, ровными краями, диаметром 2-4 мм, красно-малинового цвета, с металлическим блеском или без него.

Отобранные колонии E. coli (10 штук) пересевали на дифференциальную среду – сорбитол - агар (“Питательная среда для выделения и дифференциации E. coli O157:H7 сухая”) и инкубировали в термостате при температуре 371C в течение 18-24 часов. Питательная среда обеспечивает рост тест - штаммов: Escherichia coli О157:Н7, Shigella flexneri 1a 8516. При просмотре чашек E. coli О157:Н7 росли в виде круглых прозрачных бесцветных или слабо-розовых колоний диаметром 1,5-2,5 мм; S. flexneri 1a 8516 в виде круглых прозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний диаметром 1,0-1,5 мм.



Третий день – светлые колонии с сорбитол - агара вносили в пробирку с 5 мл среды SDS-бульона и инкубировали в термостате при температуре 371C в течение 6-12 часов. E. coli O157:H7 изменяет цвет SDS-бульона с зеленого на желтый. Это позволяет отдифференцировать сорбитол - положительные колонии E. coli О157:H7 от сорбитол - положительных микроорганизмов рода Shigella.

Посев на Эндо


Сорбитол-агар


Колонии малинового

цвета с металлическим

блеском или без него



(Отрицательный результат)

Прозрачные бесцветные или бледно-розовые колонии



(Положительный результат)


SDS бульон






Зеленый цвет -

микроорганизмы рода Shigella

Желтый цвет -

E. coli О157:H7
Рисунок 1 – Схема выделения и идентификации E. coli O157:H7 из биологического материала от животных и птицы

Оценка результатов

Выделенные из биологического материала изоляты E. coli считались принадлежащими к серовариантам О157:H7 если:

- на сорбитол - агаре росли прозрачные бесцветные или бледно-розовые колонии;

- сорбитол – положительные изоляты изменяли цвет SDS-бульона с зеленого на желтый.

Данная схема выделения и идентификация E. coli О157:H7 из биологического материала позволяет в течение 56 часов исследовать биологический и патологический материал на E. coli О157:H7.

Для идентификации выделенных изолятов проводили серологическую типизацию. Серогруппу считали установленной, если в течение 5 минут наступало полное просветление жидкости с образованием хлопьев на стекле. Все выделенные изоляты относились к серогруппе О157.



3.2. Частота выделения E. coli О157:H7 из различных экологических ниш

Для изучения частоты выделения E. coli О157:H7 среди животных, птиц исследовано 1246 проб биологического материала.



Частота выделения E. coli О157:H7 из биологического материала от сельскохозяйственных животных.

Для изучения частоты выделения E. coli О157:H7 среди сельскохозяйственных животных исследовали: 406 пробы кала от телят, 250 проб кала и 149 проб молока от коров, 77 проб от поросят, 34 пробы от лошадей.

Исследования показали, что в среднем процент выделения энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа О157:H7 от телят различных возрастов в Алтайском крае составил – 10,61%, в Новосибирской области - 6,14%.

Максимальное выделение E. coli О157:H7 (13,33%) наблюдалось из биологического материала от телят 1-10 дневного возраста Алтайского края, от здоровых телят – 11,67%, от больных гастроэнтеритом – 18,18%. В Новосибирской области частота выделения E. coli О157:H7 от телят 1-10 дневного возраста отмечалась значительно ниже - 3,57%, от здоровых – 2,38%, от больных – 7,14% (табл. 1).


Таблица 1 – Частота выделения E. coli О157:H7 от крупного рогатого скота

Вид животного

Исследовано проб

% выделения

Новосибирская область

Телята 1-10 дней:

- здоровые

- больные


56

42

14



3,57

2,38


7,14

Телята 10-30 дней:

- здоровые

- больные


187

155


32

4,81

5,16


3,13

Телята 45-180 дней:

- здоровые

- больные


50

44

6



20,59

11,36


33,33

Всего

293

6,14

Коровы: - кал

- молоко


230

149


2,17

0


Алтайский край

Телята 1-10 дней:

- здоровые

- больные


45

34

11



13,33

11,67


18,18

Телята 10-30 дней (больные)

13

7,69

Телята 45-180 дней.

55

9,09

Всего

113

10,61

Коровы (кал)

20

25

От телят 10-30 дневного возраста с признаками гастроэнтерита в Алтайском крае E. coli О157:H7 выделили в 7,69% случаев, в Новосибирской области – в 4,81%, от больных телят в 3,13%, от здоровых в 5,16% случаев. Среди телят 45-180 дневного возраста максимальное выделение наблюдалось в Новосибирской области (20,59%). Частота выделения E. coli О157:H7 отмечалась больше от больных (33,33%), чем от здоровых (11,36%) животных. В Алтайском крае выделение данного микроорганизма среди здоровых телят составило 9,09%. Из кала клинически здоровых коров данный серотип выделяли в Алтайском крае в 25% случаев, в Новосибирской области – 2,17%.

В среднем процент выделения энтерогеморрагической кишечной палочки из кала исследованных поросят составил 15,58%.

При исследовании 34 проб биологического материала от клинически здоровых лошадей энтерогеморрагическую кишечную палочку серотипа О157:H7 выделяли в 20,59% случаев.



Частота выделения E. coli О157:H7 из биологического материала от мелких домашних животных и пушных зверей.

Для выделения E. coli О157:H7 из биологического материала от мелких домашних животных и пушных зверей исследовали 90 проб кала от собак, 84 пробы от кошек, 70 проб кала от пушных зверей, из них 50 проб от лис и 20 от норок.

В среднем процент выделения энтерогеморрагической кишечной палочки из кала мелких домашних животных составил 5,17, от пушных зверей – 4,29%. От собак E. coli О157:H7 была выделена в 7,78%, от кошек - в 2,38% случаях (табл. 2).
Таблица 2 – Частота выделения E. coli О157:H7 от мелких домашних животных и пушных зверей

Вид животного

Исследовано проб

% выделения

Собаки

90

7,78

Кошки

84

2,38

Всего мелких домашних животных

174

5,17

Лисы

50

2

Норки

20

10

Всего пушных зверей

70

4,29

При исследовании кала от пушных зверей процент выделения E. coli О157:H7 составил 4,29%, в том числе от лисиц – 2%, от норок – 10%.

Таким образом, исследования показали, что E. coli O157:H7 выделяется от клинически здоровых мелких домашних животных в 5,17% случаев, что при не соблюдении санитарно-гигиенических норм общения с животными может представлять потенциальную опасность для людей.

Частота выделения E. coli О157:H7 из биологического материала от птицы.

Для изучения частоты выделения E. coli О157:H7 от птицы проведено исследование 86 проб помета птицы, в том числе 76 проб от кур и 10 проб от индеек.

В среднем процент выделения изолятов E. coli О157:H7 из помета птицы составил 9,30%. Максимальное количество изолятов (20,59%) E. coli О157:H7 отмечалось у взрослых кур, от цыплят 10-20-дневного возраста процент выделения составил 3,70. У однодневных цыплят и взрослых индеек данный серотип не обнаружен (табл. 3).

Таблица 3 – Частота выделения E. coli О157:H7 от птицы



Вид животного

Исследовано проб

% выделения

Цыплята 1 день

15

0

Цыплята 10-20дней

27

3,70

Взрослые куры

34

20,59

Индейки

10

0

Всего

86

9,30

По результатам исследования можно сделать вывод о том, что взрослые куры являются бактерионосителями энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа О157:H7. Данный микроорганизм, выделенный от кур, является потенциально опасным для обслуживающего персонала. Также опасность могут представлять яйца, загрязненные пометом.



Частота выделения E. coli О157:H7 из биологического материала от людей.

При изучении частоты выделения E. coli О157:H7 от людей было исследовано 359 проб кала, в том числе 306 проб кала от детей с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции и 53 пробы от клинически здоровых взрослых людей.

От детей в возрасте до месяца E. coli О157:H7 выделялась в 4,17%, от детей до 1 года в - 5,56% случаев. От детей от 1 года до 6 лет E. coli О157:H7 изолировалась в 1,87% случаев, а от детей 7-18 лет - в 3,13%. От взрослых людей E. coli О157:H7 выделялась в 1,89% случаях (табл. 4).
Таблица 4 – Частота выделения E. coli О157:H7 от людей

Возрастные группы

Исследовано проб

% выделения

Взрослые

53

1,89

Дети:

306

2,61

до 1 месяца

24

4,17

до 1 года

36

5,56

от 1 до 3 лет

165

1,21

от 4 до 6 лет

49

4,08

от 7 до 10

16

0

от 11 до 18

16

6,25

Всего

359

2,5

Таким образом, наибольшее выделение энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа О157:H7 наблюдалось у детей до шести летнего возраста с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции. Клинически здоровые взрослые люди являлись бактерионосителями.

По результатам исследования частоты выделения E. coli О157:H7 среди различных видов животных и человека видно, что наибольшее число выделений E. coli О157:H7 наблюдается от птицы (9,3%) и от сельскохозяйственных животных (7,69%). Среди мелких домашних животных процент выделения составил 4,92%, среди людей - 2,5%.
3.3. Сезонность выделения E. coli О157:H7

Для изучения сезонного выделения E. coli О157:H7 из кала крупного рогатого скота в течение 2005-2007 гг. каждый месяц брали пробы от телят в возрасте 1-100 дней.

Максимальное выделение E. coli О157:H7 наблюдалось в сентябре (20%), в феврале (12,5%) и в июне (11,1%). В апреле, июле, августе и октябре процент выделения E. coli О157:H7 составил 6,25; 8,69; 3,7; 5% соответственно. В декабре, январе, марте, мае, ноябре выделение энтерогеморрагической кишечной палочки не наблюдалось.

Наибольший процент выделения E. coli О157:H7 от телят зарегистрирован в летний и осенний периоды времени (6,78 и 7,25% соответственно). Зимой количество выделения изолятов E. coli О157:H7 снизилось до 5%, весной наблюдалось снижение выделения данного микроорганизма до 2,04% (рис. 2).



Рисунок 2 – Динамика выделения E. coli О157:H7 по сезонам года

Таким образом, частота выделения E. coli O157:H7 из биологического материала от телят оказалась более высокой в летний период, чем во время зимнего содержания.

3.4. Изучение биологических свойств

Изучение морфологических свойств выделенных изолятов.

Все изоляты E. coli О157:H7 представляли собой короткие, грамотрицательные палочки с закругленными краями. В мазках они располагались одиночно, реже – попарно, и обладали подвижностью.



Изучение биохимических свойств E. coli О157:H7.

Изучение биологических свойств проводилось при помощи диагностической системы ПБДЭ, для идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам была разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0».

Выделенные изоляты E. coli О157:H7 ферментировали с кислотообразованием углеводы – глюкозу, мальтозу, лактозу (92,2%), маннит (90,2%), арабинозу (82,4%); не ферментировали инозит; не утилизировали цитрат натрия, малонат натрия; не имели фенилаланиндезаминазы, уреазы (94,12%). Они давали отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра и положительную с метилротом – 76,5%, сбраживали вариабельно сахарозу (60,8%)

Большинство изолятов E. coli О157:H7 расщепляли аминокислоты лизин (74,5%) и орнитин (66,7%), не расщепляли аргинин (96,1%), продуцировали индол (66,7%), не образовывали сероводород, давали положительную реакцию со средой Кода, а также не разжижали желатин. Сорбит ферментировали 70,6% изолятов.

Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью E. coli О157:H7.

Исследования ферментативных свойств показали, что все изученные изоляты являются типичными представителями вида Escherichia coli, хотя среди них наблюдались культуры с измененными биохимическими свойствами.



Изучение биохимической вариабельности E. coli внутри серотипа О157

При проведении кластерного анализа использовались данные о биохимических свойствах выделенных изолятов E. coli О157:H7. Первоначально были выявлены наиболее и наименее вариабельные биохимические критерии. Наибольшей вариабельностью обладает часть кода, зависящая от активности декарбоксилаз орнитина и лизина, а также гидролазы аргинина. По этому критерию выделенные изоляты были сгруппированы в 5 кластеров. К наиболее консервативным биохимическим свойствам отнесли ферментацию глюкозы, арабинозы и мальтозы, цитрата и малоната натрия, а также глюкозы в присутствии цитрата. Сочетание этих критериев обеспечивает группировку изолятов в два кластера, не совпадающих по биохимическим свойствам.

В виду того, что максимальный уровень кластеризации выделенного пула изолятов достигается при использовании в кластерном анализе всех биохимических свойств, в исследованиях использовали 7 кодов, отражающих 21 биохимических признаков E. coli. Так как величина каждой составной части кода варьировала во взаимосвязи с качественными биохимическими свойствами, то кластеризацию, преимущественно, проводили по не взвешенным величинам.

Попытка сравнить различные изоляты E. coli серотипа О157, помимо значительных биохимических различий внутри этого серотипа, в подавляющем большинстве случаев показала отсутствие идентичности между этими изолятами.

В то же время кластеризация всего пула изолятов показывает их группировку по биохимическим признакам вне взаимосвязи от источника выделения. Данный феномен отражает два факта: во-первых, в однородных популяциях макроорганизмов-хозяев существует широкий спектр разных биотипов E.coli, различающихся по биохимическим свойствам даже внутри серотипа, во-вторых, встречающиеся совпадения биохимических характеристик изолятов, выделенных из различных объектов, например, два изолята из первой и второй группы (телята и коровы) и два изолята из первой и четвертой группы (телята и люди), по нашему мнению, свидетельствуют о циркуляции E. coli серотипа О157 между крупным рогатым скотом и людьми и достаточно хорошей персистенцией в течение длительных сроков у телят и коров.

Результаты кластерного анализа показывают формирование минимум семи кластеризованных по биохимическим свойствам групп E. coli внутри серотипа О157 и три изолята, не входили ни в один кластер. Данный факт показывает высокую биологическую и экологическую пластичность кишечной палочки.

Кластерный анализ изолятов E. coli внутри серотипа О157:Н7 по биохимическим критериям показывает принципиальную возможность адаптации к различным экологическим нишам E. coli О157:Н7.

Изучение патогенных свойств культур E. coli O157:H7, выделенных от животных и человека

Патогенные свойства E. coli O157:H7 изучались путем постановки биологической пробы на белых мышах.

В опыте по изучению патогенных свойств выделенных E. coli O157:H7 было выявлено, что 55,69% изолятов были патогенными для белых мышей.

Патогенными свойствами обладали изоляты E. coli O157:H7, выделенные из кала крупного рогатого скота (43,48-58,82%), из кала телят – 55,56-66,67% (табл. 5).


Таблица 5 – Патогенные свойства изолятов E. coli O157:H7, выделенных из кала крупного рогатого скота

Вид животного

Выделено изолятов

Всего

Патогенных

%

Новосибирская область

Телята 1-10 дней

2

0

0

Телята 10-30 дней:

- здоровые

- больные


9

8

1



7

7

0



77,78

87,5


0

Телята 45-180 дней:

- здоровые

- больные


7

5

2



2

0

2



28,57

0

28,57



Всего

18

10

55,56

Коровы (кал)

5

2

40

Алтайский край

Телята 1-10 дней:

- здоровые

- больные


6

4

2



4

3

1



66,67

75

50



Телята 10-30 дней (больные)

1

1

100

Телята 45-180 дней

5

3

60

Всего

12

8

66,67

Коровы (кал)

5

2

40

От новорожденных телят (1-10 дней) патогенность выделенных изолятов составила 66,67%, от телят профилакторного возраста (10-30 дней) - 77,78-100%. Патогенность выделенных изолятов из кала коров дойного стада составила 40%, от поросят - 58,33%, от лошадей - 71,43%.

От собак и кошек патогенными свойствами обладали 71,43%, от 50% изолятов E. coli O157:H7 соответственно. Выделенные культуры E. coli O157:H7 от пушных зверей не обладали патогенными свойствами.

Патогенность изолятов E. coli O157:H7, выделенных из помета птицы, составила 50%. Максимальное выделение патогенных изолятов E. coli O157:H7 (100%) отмечалось от цыплят 10-20-ти дневного возраста, в то время как изоляты выделенные от взрослых кур обладали патогенными свойствами в 42,86% случаев (табл. 6).


Таблица 6 – Патогенные свойства изолятов E. coli O157:H7, выделенных из помета птицы

Вид животного

Выделено изолятов

Всего

Патогенных

%

Цыплята 10-20 дней

1

1

100

Взрослые куры

7

3

42,86

Всего

8

4

50

Изоляты E. coli O157:H7, выделенные из кала людей в 55,5% случаев обладали патогенными свойствами. Все изоляты энрерогеморрагической кишечной палочки из кала детей до месяца и от 11 до 18 летнего возраста были патогенные для белых мышей. Изоляты от детей до года и от 1 до 3-х летнего возраста только в 50% случаев обладали патогенными свойствами (табл. 4).

От взрослых клинически здоровых людей 100% изолятов E. coli О157:H7 обладали патогенными свойствами. Данный факт указывает на то, что они являются бактерионосителями патогенной кишечной палочки серотипа O157:H7 без проявления симптомов заболевания.

По результатам исследования патогенных свойств E. coli О157:H7 среди различных видов животных и человека видно, что патогенные изоляты выделялись от сельскохозяйственных животных в 57,63% и от людей – в 55,5% случаев. Изоляты E. coli О157:H7, выделенные от мелких домашних животных и птицы, обладали патогенными свойствами в 50% случаев.



Изучение антибиотикорезистентности изолятов E. coli О157:H7, выделенных от животных и птицы

Для определения чувствительности 31 изолята E. coli O157:H7 к антибактериальным веществам, использовались микропланшеты с внесенными в лунки антибактериальными препаратами.

Изоляты E. coli О157:H7, выделенные из кала крупного рогатого скота, мелких домашних животных и птицы обладали высокой чувствительностью к энроколи (73,49%), коливету (72,27%) и к леномаку (71,24%). К таким антибактериальным препаратам как энрофлоксацин, родотиум, ампициллин, стрептомицин, ципрофлоксацин чувствительность была на уровне 60-70%. К апромицину, амоксициллину, рифану, эритромицину и квинабику изоляты E. coli О157:H7 обладали резистентностью.

Для определения чувствительности 12 изолятов E. coli O157:H7 к антибактериальным веществам использовали стандартные бумажные диски с различными антибиотиками.

Выделенные из кала лошадей и поросят изоляты E. coli О157:H7 обладали высокой чувствительностью к оксациллину, гентамицину (25 мм), офлоксацину (23 мм), норфлоксацину (24 мм.), нетилмицину (22 мм), левофлоксацину (21 мм) и фурадонину (21 мм.). К амоксициллину, полимексину, клиндамицину, доксициллину и тилозину выделенные изоляты были резистентны.

Установлено, что изоляты E. coli О157:H7 выделенные от различных видов животных были резистентные к антибактериальным препаратам из групп: макролиды (тилозин, эритромицин), линкозамиды (клиндамицину), полусинтетические пенициллины (амоксициллину, бензилпенициллину) и цефалоспорины (цефазолину).

Высокая чувствительность выделенных изолятов регистрировалась к таким антибактериальным группам, как фторхинолоны (левофлоксацин, офлоксацин, норфлоксацин), фторхинолы (энрофлоксацин), аминогликозиды (амикацин, гентамицин, нетилмицин), полипептидной группе антибиотиков (коливет, энроколи) и комплексным антибиотикам (зинаприм, дитрим, леномак, родотиум).

3.5. Изучение эпизоотической значимости носительства E. coli О157:H7 у мелких домашних животных.

Для выяснения являются ли мелкие домашние животные носителями или могут заболевать геморрагическим колитом, был проведен опыт по заражению щенков и котят патогенными для белых мышей изолятами E. coli О157:H7, выделенными от собак. Для этого по признаку аналогов были сформированы три группы из щенков и три – из котят. До начала опыта животные прошли процесс адаптации в виварии института. На 8-ой день щенки были размещены в вольерах, а котята в клетках по 3 головы в каждой. Первоначально у всех опытных животных были взяты пробы кала на наличие E. coli O157:H7 и общее клиническое обследование: определяли габитус, исследовали видимые слизистые оболочки, волосяной покров, кожу, лимфоузлы. Животные были клинически здоровыми.

Щенкам однократно, орально задавали взвесь культур E. coli О157:H7 в дозах: 1-опытной группе - 2 млрд. КОЕ, 2-й - 4 млрд. КОЕ, 3-й - 6 млрд. КОЕ.

Котятам однократно, орально задавали взвесь культур E. coli О157:H7 в дозах: 1-опытной группе - 1 млрд. КОЕ, 2-й - 2 млрд. КОЕ, 3-й - 3 млрд. КОЕ.

Ежедневно, в течение 21 дня, проводилось клиническое исследование опытных животных. При этом учитывалось клиническое состояние животного, подвижность, поедаемость корма, наличие или отсутствие жажды, диареи.

За время проведения опыта клиническое состояние подопытных животных не изменилось, ни одно животное не пало и у них не наблюдалось признаков геморрагического колита. У всех подопытных животных во время эксперимента сохранялся хороший аппетит, жажда отсутствовала, температура, пульс, дыхание находились в физиологической норме, диарея отсутствовала.

При бактериологическом исследовании кала на 21 день опыта у всех животных была выделена патогенная для белых мышей E. coli O157:H7. При вскрытии животных патологических изменений внутренних органов не обнаружено.

В течение двух лет велось наблюдение за двумя собаками из первой и третьей опытных групп. Каждые три месяца у них брались пробы кала и исследовались на наличие E. coli O157:H7. За время наблюдения у опытных животных выделялась патогенная для белых мышей энтерогеморрагическая кишечная палочка серотипа O157:H7.

Таким образом, мелкие домашние животные продолжительное время являются бактерионосителями E. coli O157:H7, выделяющие ее во внешнюю среду, что при несоблюдении санитарно-гигиенических норм общения людей с животными - бактерионосителями повышается риск заражения E. coli O157:H7 и заболевания людей геморрагическим колитом и гемолитико-уремическим синдромом.

3.6. Изучение патогенности изолятов E. coli О157:H7, выделенных от крупного рогатого скота, для мелких домашних животных

Для изучения патогенности изолятов E. coli О157:H7, выделенных от крупного рогатого скота, для мелких домашних животных был проведен опыт по заражению щенков и котят этими патогенными для белых мышей изолятами, для чего были использованы 9 щенков и 9 котят аналогов в возрасте 2 месяца, которые после прохождения адаптации были размещены в клетках и вольерах по 3 головы в каждой.

Щенкам однократно, орально задавали взвесь культур E. coli О157:H7 в дозах: 4-опытной группе - 2 млрд. КОЕ, 5-й - 3 млрд. КОЕ, 6-й - 4 млрд. КОЕ.

Котятам однократно, орально задавали взвесь культур E. coli О157:H7 в дозах: 4-опытной группе - 1 млрд. КОЕ, 5-й - 2 млрд. КОЕ, 6-й - 3 млрд. КОЕ.

За время проведения опыта клиническое состояние подопытных животных не изменилось, ни одно животное не пало и у них не наблюдалось признаков геморрагического колита. Также у всех опытных животных во время эксперимента сохранялся хороший аппетит, жажда отсутствовала, температура, пульс, дыхание находились в пределах физиологической нормы, диарея отсутствовала, что указывает на то, что E. coli O157:H7 не обладает патогенными свойствами для мелких домашних животных. Но при бактериологическом исследовании кала на 21 день опыта, у всех опытных животных была выделена патогенная для белых мышей E. coli O157:H7.

В течение двух лет, каждые три месяца, у двух опытных животных (собаки) брались пробы кала и исследовались на наличие E. coli O157:H7. В течение этого времени у опытных животных выделялась патогенная для белых мышей E. coli O157:H7.

Таким образом, экспериментальное инфицирование патогенными изолятами E. coli O157:H7 не привело к клиническому проявлению болезни у опытных животных, при этом последующее выделение данного микроорганизма из кала животных на 21 день доказывает, что мелкие домашние животные становятся бактерионосителями патогенной для белых мышей E. coli O157:H7. Вероятно для проявления патогенности E. coli O157:H7 необходимы условия, снижающие резистентность организма животных.
ВЫВОДЫ

1. Кал животных в 27,7 раз больше контаминирован микроорганизмами рода Proteus, чем фекалии людей. Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост E. coli O157:H7, что препятствует ее выделению из биологического материала и снижает информативность методики утвержденной Федеральным центром Госсанэпиднадзора.

2. E. coli О157:H7 выделяется от крупного рогатого скота, мелких домашних животных, пушных зверей, птиц и людей. Наибольшее выделение E. coli О157:H7 регистрируется от мелких домашних (9,3%), сельскохозяйственных животных (7,69%) и птицы (4,92%). Выделение кишечной палочки серотипа О157:H7 среди людей достигает - 2,5%.

3. Наибольший процент выделения E. coli О157:H7 от телят отмечается в летний и осенний период времени года (6,78 и 7,25% соответственно). Минимальное выделение данного микроорганизма (до 2,04 %) наблюдается в весенний период года.

4. Выделенные культуры являются типичными представителями вида Escherichia coli серотипа О157:H7 по морфологическим и ферментативным свойствам. Стабильность биохимических признаков отмечалась в отношении: цитрата и малоната натрия, аргинина, финилаланина, уреазы, глюкозы, лактозы, инозита, мальтозы, желатина, среды Кода и Фогеса-проскауэр. В отношении лизина (74,5%), орнитина (66,7), индола (66,7), ацетилметилкарба (72,5), сахарозы (60,8), сорбита (70,6%) наблюдалась вариабельность биохимических признаков. Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью E. coli О157:H7. Компьютерная экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2.0» позволяет по биохимическим свойствам быстро идентифицировать выделенные энтеробактерии.

5. Установлена биохимическая разнородность изолятов E.coli внутри серотипа О157. Результаты кластерного анализа показывают формирование минимум семи кластеризованных по биохимическим свойствам групп E.coli внутри серотипа О157 и три изолята, не входили ни в один кластер. Данный факт показывает высокую биологическую и экологическую пластичность кишечной палочки, выделенную как от различных видов животных и человека, так и от одного вида животных.

6. Установлено, что 55,68% выделенных изолятов E. coli О157:H7 были патогенными для белых мышей. Большее количество патогенных изолятов выделялось от сельскохозяйственных животных (57,63%) и людей (55,5%). Изоляты выделенные от мелких домашних животных, пушных зверей и птицы обладали патогенными свойствами в 50% случаев.

7. Выделенные изоляты резистентны к антибактериальным препаратам из следующих групп: макролиды, линкозамиды, полусинтетические пенициллины и цефалоспорины. Чувствительность выделенных изолятов наблюдалась к антибактериальным препаратам из групп: фторхинолоны, фторхинолы, аминогликозиды, полипептидной группе антибиотиков и комплексным антибиотикам.

8. Мелкие домашние животные продолжительное время (до двух лет) являются бактерионосителями E. coli O157:H7, что подтверждает их эпизоотологическую значимость и при не соблюдении санитарно-гигиенических норм общения людей с животными - бактерионосителями повышает риск заражения E. coli O157:H7 и заболевание людей геморрагическим колитом и гемолитико-уремическим синдромом.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена усовершенствованная схема выделения и индикации E. coli O157:H7 из биологического материала от животных и птицы;

Разработаны методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.).

Результаты исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов по специальности «Ветеринария».

По материалам исследований подана заявка на патент РФ «Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27.11.2006.

Разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0», получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ


ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Нестерова И.С. Распространение E. coli О157:Н7 среди сельскохозяйственных животных, птицы и продуктов животного происхождения / Соавт.: В.Ю. Коптев, Н.А. Шкиль, Е.А. Орлова // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: матер. Сибирского Междунар. ветеринарного конгресса. – Новосибирск, 2005. – С. 138-139.

  2. Нестерова И.С. Бактерионосительство E. coli O157:H7 среди животных и птицы / Соавт.: В.Ю. Коптев, Н.А. Шкиль // Аграрная наука сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Кыргызстана: труды Междунар. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2005. – т.2. – С. 262-265.

  3. Нестерова И.С. Распространение E. coli O157:H7 среди мелких домашних животных / Соавт.: В.Ю. Коптев, Н.А. Шкиль // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние животные. – 2005. – №3. – С. 33-34.

  4. Нестерова И.С. Распространение E. coli O157:H7 среди животных и птицы / Соавт.: В.Ю. Коптев, Н.А. Шкиль // Практик. – 2005. – № 11-12. – С. 49-51.

  5. Нестерова И.С. Патогенность E. coli O157:H7 для мелких домашних животных/ Соавт.: Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Матер. VI Сибирской ветеринарной конф. – Новосибирск, 2006. – С. 33-35.

  6. Нестерова И.С. Изучение патогенности E. coli O157:H7 для мелких домашних животных / Соавт.: В.Ю. Коптев, Е.А. Петрова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: труды II Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых – Новосибирск, 2006. – С. 422-427.

  7. Нестерова И.С. Распространение и биологические свойства E. coli O157:H7, выделенной от домашних животных и птицы / Соавт.: Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. – Москва, 2006. – С.403-406.

  8. Нестерова И.С. Особенности распространения, патогенность и чувствительность к антибиотикам E. coli O157:H7/ Соавт.: Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: матер. Междунар. конф. – Ульяновск, 2006. – С. 185-188.

  9. Нестерова И.С. Распространение E. coli O157:H7 среди мелких домашних животных и людей / Соавт.: Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: 3-я Российская науч.-практ. конф. с международным участием. – Новосибирск, 2006. – С. 129-130.

  10. Нестерова И.С. Дискриминация штаммов некоторых таксономических единиц семейства энтеробактерий по биохимическим характеристикам с использованием кластерного анализа и базы данных / Соавт.: В.Н. Афонюшкин, В.Ю. Коптев, Е.К. Табатчикова // Информационные технологии, системы и приборы в АПК «Агроинфо – 2006»: матер. междунар. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2006. – С.91-93.

  11. Нестерова И.С. Биологические свойства и распространение E. coli O157:H7 среди мелких домашних животных и птицы / Соавт.: Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев, Е.Н. Петрова // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири: Сб. науч. тр. СО РАСХН. ИЭВСиДВ. – Новосибирск, 2006. – С. 302-307.

  12. Нестерова И.С. Биохимическая вариабельность изолятов E. coli O157:H7 / Соавт.: В.Н. Афонюшкин, Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2007. – №1. – С. 83-85.

  13. Нестерова И.С. Биохимический полиморфизм E. coli серотипа O157:H7 / Соавт.: В.Н. Афонюшкин, Н.А. Шкиль, В.Ю. Коптев // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2007. – №4. – С. 75-77.

  14. Онищенко И.С. Моделирование колибактериоза мелких домашних животных вызванного E. coli O157:H7 // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: матер. VIII Сиб. вет. конф. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2008. – С. 244-247.


скачать


Смотрите также:
Фенотипические свойства и эпизоотологическая значимость e. Coli o157: H7 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.94kb.
Применение озона в бактериологической диагностике туберкулеза 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
352.56kb.
УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
389.72kb.
Экспериментальная модель гриппа а/H5N1 на представителях вида кошка домашняя 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 06. 02
262.18kb.
Разработка s- и r-бруцеллёзных эритроцитарных диагностикумов, изучение их эффективности при бруцеллезе животных 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
341.63kb.
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.59kb.
Разработка новых методов генодиагностики болезни марека и определение их роли в системе противоэпизоотических мероприятий 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
322.73kb.
Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
304.73kb.
Влияние биологически активных веществ на иммунный статус норок при алеутской болезни и иммунодефицитных состояниях 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
285.95kb.
Комплексная сравнительная оценка эпизоотич еской ситуации туберкулеза животных и методов его диагностики в сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
299.94kb.
Лечебно-профилактическая эффективность витартила и йодантипирина при респираторных болезнях телят вирусно-бактериальной этиологии 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
312.01kb.
Критерии оценки эпизоотической ситуации и прогнозирование заболеваемости крупного рогатого скота некробактериозом на основе искусственных нейронных сетей 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
359.83kb.