Главная стр 1
скачать


На правах рукописи
КОВАЛЕВСКАЯ

АНАСТАСИЯ АНДРЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ГРИППА А/H5N1

НА ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ ВИДА КОШКА ДОМАШНЯЯ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология,

онкология и морфология животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук


НОВОСИБИРСК – 2010

Работа выполнена в Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет».



Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Околелов Владимир Иванович,
кандидат биологических наук

Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Плешакова Валентина Ивановна,
кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник

Юшков Юрий Георгиевич
Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» (ФГУ ВНИИЗЖ)

Защита состоится « 16 » ноября 2010 г. в « 15 00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ИЭВСиДВ, а/я 8, тел./факс (8-383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «_______» октября 2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева


  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В отношении гриппа все чаще используется термин «эмерджентные болезни» (S.S. Morse, 1995; D.M. Morens, G.K. Folkers, A.S. Fauci, 2004) (от англ. emerging disease) – новые болезни, возникающие в результате изменения известных патогенов или известные инфекции, распространившиеся на новые территории/популяции в процессе эволюции.

Выделение от диких птиц высоко патогенных вирусов гриппа субтипа H5N1 стало приобретать массовый характер с середины 90-х годов в странах Юго-Восточной Азии.

Предок циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа А/H5N1 был впервые выделен от гуся в 1996 году и от погибшего человека в 1997 году в Китае (K.S. Li, 2004 и др.). Эволюционируя и распространяясь, он стал реальной угрозой сначала для птицеводства, а в последствие и для человека. К началу ХХI века стало очевидно, что именно вирусы гриппа А/H5N1 являются потенциально пандемичными (D.L. Suarez, 2000; R.G. Webster, 2001; T. Horimoto, Y. Kawaoka, A.S. Lipatov, 2005; Г.Г. Онищенко, Д.К. Львов, 2006, 2007 и др.).

В 2005 году в Китайской провинции Цинхай была зафиксирована крупнейшая вспышка заболевания диких птиц.

Уже в середине 2005 года вирусы, подобные выделенным от погибших птиц в провинции Цинхай, вызвали вспышки на территории Сибири, а в последствие на большей части России. Это было первым появлением вирусов высоко патогенного гриппа птиц A/H5N1 в России. Возникла необходимость определить биологические свойства этих вирусов для понимания возможных последствий их распространения.

При проведении исследований были описаны особенности патогенеза на различных животных моделях: на хорьках (L.A. Zitzow, 2002; E.A. Govorkova, 2005; A.S. Lipatov, 2006; H.L. Yen, В.А. Евсеенко, 2007 и др.), мышах (В.А. Евсеенко, 2007; CKJ Paniker, 1972; A. S. Lipatov, 2003, 2005 и др.), красных лисах (L. A. Reperant, 2008), собаках (M. Giese, 2008) и кошках (CKJ Paniker, 1970; Т. Kuiken, 2004; K. Karaca, 2005; G.F. Rimmelzwaan, 2006; М. Leschnik, 2007). На протяжении последних лет высоко патогенные вирусы А/H5N1 были выделены от тигров и леопардов (J. Keawcharoen, 2004; R. Thanawongnuwech, 2005 и др.), домашних кошек (T. Songserm, S.L. Yingst, 2006; R. Klopfleisch, 2007; T.W. Vahlenkamp, 2008), пальмовых циветт Оустона (S.I. Roberton, 2006), домашних собак (T. Songserm, 2006), каменных куниц (R. Klopfleisch, 2007), американских норок (B. Klingeborn, 1985; L. Englund, 1986; T. Mörner, 2006 и др.), диких енотов (Jeffrey S. Hall, 2008), диких грызунов (J. Zhou, 2009) и других млекопитающих. Заболевание у представителей этих видов протекает чаще по типу респираторной инфекции, а также с вовлечением в патологический процесс нескольких систем организма. Участие вышеперечисленных видов животных в распространении и развитии гриппозной инфекции остается малоизученным и требует проведения детальных исследований.



Цель исследований – воспроизвести в экспериментальных условиях у представителей вида кошка домашняя инфекцию, обусловленную вирусом гриппа птиц А/H5N1, и изучить в динамике проявление основных характеризующих ее показателей.

Задачи исследований:

  • изучить динамику проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа H5N1;

  • изучить возможность горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А субтипа H5N1 у представителей вида кошка домашняя;

  • изучить динамику развития патоморфологических изменений в органах и тканях у кошек домашних, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А субтипа H5N1.

Научная новизна. Подтверждена возможность заражения представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа H5N1, выделенного от домашней птицы в период эпизоотии гриппа, и возможность горизонтальной передачи вируса внутри вида.

Получены данные о клиническом проявлении болезни, описаны гематологические, серологические показатели, патоморфологические изменения в динамике развития инфекционного процесса у домашних кошек.

Подтверждено выделение вируса инфицированными кошками во внешнюю среду, что определяет их возможное участие в эпизоотическом процессе гриппозной инфекции.

Дана сравнительная оценка классическому вирусологическому и молекулярно-биологическому методу количественного исследования вируса в клиническом и патологическом материале.



Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований вносят вклад в изыскание новых возможных хозяев и изучение межвидовой передачи вирусов гриппа.

Материалы диссертационной работы могут быть использованы при написании соответствующих разделов учебных пособий и руководств при подготовке специалистов в высших, средних специальных и научно-исследовательских учреждениях.



На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом А/H5N1 в период эпизоотии гриппа птиц».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 6-й межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию СибНИВИ – ВНИИБТЖ (Омск, 2007), на 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» (Москва, 2007), на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО ОмГАУ (Омск, 2007, 2008, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней», посвященной 70-летию учения о природной очаговости болезней Е.Н. Павловского (Омск, 2009), на международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц», посвященной 80-летию УРНИВИ (Екатеринбург, 2010).

Публикации результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 10 научных работах, 2 из них – в ведущих научных журналах («Ветеринария» и «Ветеринарная патология»), рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 59 рисунками. Список литературы включает 140 источников, в том числе 42 отечественных и 98 работ иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Динамика проявления различных показателей, характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у представителей вида кошка домашняя вирусом гриппа А субтипа H5N1.

  2. Возможность горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А субтипа H5N1 у представителей вида кошка домашняя.

  3. Патоморфологические изменения в органах и тканях у кошек домашних, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А субтипа H5N1.

  1. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

    1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии, паразитологии, инфекционных и инвазионных болезней животных Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет». Проведение лабораторных исследований осуществлялось в отделе зоонозных инфекций и гриппа, отделе микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и вирусологическом отделе Государственного учреждения Омской области «Омская областная ветеринарная лаборатория».

При проведении экспериментальной части работы объектом исследований послужили клинически здоровые беспородные котята, серонегативные в отношении вируса гриппа А/Н5, возраст которых на момент проведения опыта составил 3,5-4 месяца. Перед проведением эксперимента котята были выдержаны на карантине в течение 30 дней.

Общее количество подопытных животных – 14 разнополых особей, 10 из которых участвовали в основном опыте, 2 были введены на 2-й день эксперимента и 2 служили отрицательным контролем.

Все работы, связанные с инфекционным материалом, производили в боксах биологической безопасности II класса защиты, а также в соответствии с нормативными документами.

Заражение подопытных животных производили штаммом вируса гриппа А/H5N1   A/goose/Krasnozerskoye/627/05 с физическим титром 1010,2/мл, предоставленного из репозитория отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Вирус был выделен в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) из легкого погибшего гуся в период эпизоотии гриппа птиц в селе Краснозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года.

Инфицирование производили путем интраназального введения вируссодержащей суспензии в объеме 500 мкл, по 250мкл в носовую полость с каждой стороны с титром 106ЭИД50/мл. Определение ЭИД50 (50%-ной эмбриональной инфекционной дозы) проводили титрованием вируса в РКЭ с обработкой полученных данных по методу Рида-Менча. Процедуру заражения опытных животных осуществляли под ингаляционным эфировым наркозом.

Наблюдение проводили в течение 21 дня. Клинические признаки болезни регистрировали визуально, ежедневно проводилась термометрия, аускультация грудной клетки и отбор проб носоглоточных смывов. С интервалом в 3 дня производили отбор проб крови для серологического исследования на наличие специфических антител и определения гематологических показателей.

Все погибшие и убитые в ходе эксперимента животные подвергались патологоанатомическому исследованию. Убой подопытных животных производили тотальным обескровливанием при помощи кардиальной пункции, под эфировым наркозом. При вскрытии производили отбор фрагментов внутренних органов для проведения гистологических и вирусологических исследований. Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Титрование вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, тканях органов и моче, осуществляли в РКЭ параллельно с использованием метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). В качестве калибровочных стандартов, использовали ряд последовательных разведений аллантоисной жидкости с известным титром.

Рисунок 1 – Схема проведения эксперимента.

Определение содержания гемоглобина проводили классическим калориметрическим методом по Сали. Подсчет количества форменных элементов крови проводили пробирочным методом с использованием камеры Горяева, расчет производили по соответствующим формулам. Мазки крови для подсчета лейкоцитарной формулы окрашивали по Романовскому-Гимза и микроскопировали при помощи светового микроскопа.

Образцы для патолого-гистологического исследования фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида, приготовленного на растворе Хенкса (рН 7,2-7,4). Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по методу Вейгерта   ван Гизона. Для получения полутонких срезов исследуемые образцы тканей органов постфиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия. Полученные препараты обезвоживали по стандартной методике, заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы окрашивали 1%-ным раствором азура II.

Материалом для проведения иммуногистохимического исследования служили парафиновые срезы. Иммунопероксидазная реакция выполнялась с использованием набора реагентов «Novocastra peroxidase dataction system RE7120-K500» «Novocastra Ltd», США. В качестве специфических антител использовались антитела к нуклеопротеину (NP) вируса гриппа А/H5N1 в разведении 1:100, предоставленные лабораторией R.G.Webster.


    1. Результаты исследований

      1. Динамика проявления различных показателей,

характеризующих экспериментальный инфекционный процесс, вызываемый у кошек вирусом гриппа А субтипа H5N1
При воспроизведении в экспериментальных условиях у кошек инфекции, вызываемой вирусом гриппа А субтипа H5N1, были изучены в динамике проявления основных характеризующих ее показателей.

        1. Клиническая картина

Инкубационный период у кошек при интраназальном заражении составил 8-12 часов.

Первые проявления болезни характеризовались повышением температуры тела, общим угнетением, снижением аппетита, взъерошенностью волосяного покрова и нарастающим обезвоживанием.

В дальнейшем болезнь преимущественно протекала по типу респираторной инфекции, сопровождаясь конъюнктивитами, воспалением третьего века, отеком межчелюстного пространства и лицевой части головы, одно- и двусторонними серозными ринитами, нарастающее угнетение, животные не реагировали на адекватные раздражители. Наблюдалось нарушение функций со стороны аппарата дыхания: чихание, кашель, затрудненное учащенное дыхание; со стороны аппарата пищеварения – незначительные отклонения, проявляющиеся диареей. Регистрировалась прогрессирующая патология со стороны центральной нервной системы, характеризующаяся нарушением координации движений, неспособностью сохранять равновесие. Наряду с общим угнетением, временно наблюдалась повышенная возбудимость животных. У отдельных особей отмечалась симптоматическая эпилепсия, характеризующаяся приступами тонико-клонических судорог, что свидетельствует о вовлечении в патологический процесс центральной нервной системы.

При проведении ежедневной термометрии и регистрации температурных показателей было определено, что первая волна гипертермии наблюдалась со 2-го по 5-й день эксперимента, затем вторая – с 9-го по 11-й день, вероятнее всего обусловленная осложнением гриппозной инфекции вторичной микрофлорой. В промежутке между 5-м и 9-м днем температура удерживалась на верхней границе физиологических показателей, а после 11-го дня температурные показатели стабилизировались в пределах нормы (рис. 2).



Рисунок 2 – Среднесуточные показатели температуры тела подопытных животных на протяжении эксперимента.



        1. Гематологические показатели

Содержание гемоглобина в крови подопытных кошек на протяжении эксперимента находилось на границе максимальных физиологических показателей, либо характеризовалось незначительной плейохромией, вероятно обусловленной сгущением крови вследствие интоксикации организма и усиленного потоотделения при лихорадочном состоянии. К 9-му дню показатели содержания гемоглобина в крови стабилизировались в пределах физиологической нормы.

Через 24 часа после инфицирования у животных регистрировали лейкоцитоз. Количественные показатели достигли 19,3 тыс/мкл, средний показатель по группе составил 18,5 тыс/мкл. С 3-го по 9-й день эксперимента наблюдалась ярко выраженная лейкоцитопения. Отмечено снижение процентного соотношения лимфоцитов, увеличение процента нейтрофилов, непосредственно за счет преобладания сегментоядерных форм клеток (сдвиг ядра вправо). Результаты наших исследований согласуются с данными А.А. Смородинцева с соавторами (1977).



        1. Серологические показатели

Развитие инфекционной патологии, обусловленной вирусом гриппа А и непосредственно субтипом Н5N1, сопровождается синтезом и накоплением в сыворотке крови специфических антител. В ходе проведения эксперимента подопытные кошки положительно реагировали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с высокими титрами специфических антител, начиная с 12-го дня, была отмечена позитивная сероконверсия. Наивысшие значения титров (> 1/5120) установлены с гомологичным антигеном вируса, используемого для инфицирования подопытных животных (табл. 1).

Таблица 1 – Динамика синтеза и уровень антител у инфицированных кошек.



Эритроциты

Антиген A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

сутки после инфицирования, титр

9

12

15

18

21

гуся

-

160/-/-

1280/80

2560/160

>5120/160

лошади

-

1280/-/-

>5120/1280

>5120/1280

>5120/1280

человека

-

640/-/-

2560/320

>5120/320

>5120/320

Эритроциты

Антиген A/common gull/Chany/P/2006

сутки после инфицирования, титр

9

12

15

18

21

гуся

-

40/-/-

320/40

640/40

2560/40

лошади

-

640/-/-

>5120/320

>5120/640

>5120/640

человека

-

80/-/-

320/40

320/40

1280/40

Примечание: через дробь указаны титры антител в РТГА

        1. Длительность и динамика выделения вируса

Спустя сутки после заражения подопытные животные выделяли вирус во внешнюю среду. Ежедневно концентрация вируса увеличивалась. Максимальные значения составили 104,7-105,0 ЭИД 50/мл на 5 8-й день после инфицирования, пик выделения вируса в носоглоточных смывах – 105,0 ЭИД 50/мл зарегистрирован на 6-й день методом ОТ-ПЦР и 8-й – культивированием в РКЭ. К 9-му дню концентрация вируса постепенно снижалась, и к 16-му дню, при исследовании клинического материала, выделение вируса прекратилось (рис. 3).

(±0,4)

(±0,6)

(±0,6)

(±0,5)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,5)

(±0,8)

(±0,9)

(±0,6)

(±0,3)

(±0,5)

(±0,6)

(±0,5)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,3)

(±0,5)

(±0,5)

(±0,9)

(±0,9)

Рисунок 3 – Средние титры вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, М(±m)

        1. Количественные показатели содержания вируса

в тканях органов и моче
Анализируя полученные в ходе проведения исследований данные по изучению аффинитета органов и систем организма кошек к вирусу гриппа А/Н5N1, а также определения вирусной нагрузки методами ОТ-ПЦР и культивированием в РКЭ, можно отметить, что средние показатели содержания вируса в легких, трахее, селезенке, головном мозге, почках, сердце и кишечнике достаточно схожие и не превышают 0,3 log10 ЭИД50/мл 10%-ной суспензии/лаважа тканей органов. Оба способа количественного исследования подтверждают пантропность используемого для заражения вируса, высокую концентрацию его в носоглоточных смывах, тканях органов и моче и демонстрируют аналогичность полученных результатов (рис. 4).

Рисунок 4 – Средние титры вируса, содержащегося в тканях органов и моче, М(±m).

Значительные различия установлены при исследовании печени и мочи, причем значения титра вируса в печени на 50% больше при исследовании методом культивирования в РКЭ, чем методом ОТ-ПЦР, а в моче концентрация вируса на 84,6% выше при исследовании методом ОТ-ПЦР, нежели культивированием в РКЭ. Вероятно, данные различия связаны с присутствием веществ, снижающих чувствительность данных методов исследований. Присутствующий в печени гепарин является ингибитором ПЦР, а содержание в моче солей, различных органических кислот и продуктов метаболизма, образующихся в процессе жизнедеятельности организма животного, оказывает токсическое воздействие на развитие эмбрионов.

Результаты наших исследований по определению титров вируса, содержащегося в носоглоточных смывах, тканях органов и моче согласуются с данными полученными CKJ Paniker (1970, 1972), Т. Kuiken, G.F. Rimmelzwaan, S. L. Yingst (2006), М. Leschnik (2007) и др.


        1. Результаты иммуногистологического исследования

Иммуногистохимическим методом исследования определено наличие и локализация вирусного антигена в некоторых тканях органов. В головном мозге установлено диффузное и мелкоочаговое накопление вирусного антигена в области коры полушарий, в легких – в мононуклеарах, альвеолярном и бронхиальном эпителии, в печени – в цитоплазме гепатоцитов, в почках – в эндотелии почечных клубочков, в лимфатических узлах – в эндотелиальных клетках и лимфоцитах, в тонком и толстом кишечнике – в цитоплазме энтероцитов и мононуклеарах. Наиболее выражена экспрессия вирусного антигена на границе нормальной и вовлеченной в патологический процесс ткани органов. Полученные нами данные согласуются с таковыми G.F. Rimmelzwaan с соавторами (2006).

      1. Результаты изучения возможности горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А/H5N1 у кошек

При изучении возможности внутривидовой передачи вируса гриппа А/H5N1 у кошек отмечено, что спустя 12 часов регистрировались первые клинические признаки болезни. Спустя сутки подопытные животные, после введения их в основную группу, выделяли вирус во внешнюю среду. Ежедневно концентрация вируса увеличивалась. Максимальные значения концентрации вируса в носоглоточных смывах отмечали перед гибелью животных – 105,2 и 105,8 ЭИД 50/мл при исследовании методом ОТ-ПЦР и 105,3 и 105,6 ЭИД 50/мл – методом культивирования в РКЭ, на 4 и 6 сутки соответственно (рис. 5).

Рисунок 5 – Титры вируса, содержащегося в носоглоточных смывах от кошек, при изучении возможности внутривидовой передачи вируса.

Характер клинической и патологоанатомической картины был сходен с таковой у животных основного эксперимента, с преобладанием патологии со стороны аппарата дыхания.

В результате проведенных исследований по определению титров вируса в тканях органов и моче павших животных при изучении возможности горизонтального пути внутривидовой передачи вируса гриппа А/H5N1, установлено присутствие вируса во всех органах, выбранных для исследования, а также в моче (рис. 6).


Рисунок 6 – Титры вируса, содержащегося в тканях органов и моче кошек, при

изучении возможности внутривидовой передачи вируса.

Результаты проведенных нами исследований по изучению возможности внутривидовой передачи вируса гриппа А/H5N1 у представителей семейства кошачьих согласуются с данными R. Thanawongnuwech (2005) и G. F. Rimmelzwaan (2006). Полученные данные оставляют ряд вопросов, на которые предстоит ответить при проведении дальнейших исследований.


      1. Динамика развития патоморфологических изменений

в органах и тканях у кошек, экспериментально инфицированных вирусом гриппа А/H5N1

        1. Результаты патологоанатомического исследования

В проведенном нами эксперименте гибель подопытных животных наблюдали с 6-ого по 8-ой день после инфицирования.

Динамику развития патологических изменений оценивали при диагностическом убое кошек на 1, 3, 5, 7 и 12-й дни опыта.

При патологоанатомическом вскрытии животного, убитого через 24 часа после инфицирования, изменений на макроуровне не наблюдалось. У павших и убитых животных преобладала патология со стороны органов аппарата дыхания. При убое животных на 3, 5, 7 и 12-й дни опыта наблюдалась стадийность развития крупозной пневмонии до тотального поражения легочной ткани. Поражения внутренних органов характеризовались явлениями геморрагического диатеза, а также воспалением и некрозами, что также отмечено в работе Keith G. Mansfield (2007) по изучению тропности вируса и патогенеза гриппозной инфекции у млекопитающих и В.А. Евсеенко с соавторами (2007) по изучению гриппа птиц A/H5N1 на мышиной и хорьковой модели.

При вскрытии животных, убитых на 21-й день после инфицирования, мы наблюдали остаточные явления патологоанатомических изменений, регистрировавшихся у павших и ранее убитых животных в ходе проведения эксперимента.



        1. Результаты патолого-гистологического исследования

При проведении патолого-гистологического исследования нами была поставлена основная задача – изучение динамики развития патологических изменений, происходящих в тканях органов кошек при экспериментальном инфицировании вирусом гриппа А субтипа Н5N1.

Течение инфекционного процесса в тканях головного мозга сопровождалось выраженными воспалительными изменениями (диффузная и очаговая лимфоцитарная инфильтрация), нарушением гемодинамики (отек, парез сосудов, диапедезные кровоизлияния), морфологическими проявлениями ДВС-синдрома (тромбообразование). В мозжечке на 5-й день обнаружены дистрофические изменения клеток Пуркинье. К 7-му дню регистрировались крупные кровоизлияния в мягкие мозговые оболочки. Поражение головного мозга – развитие энцефалита у каменной куницы при заражении вирусом гриппа A/H5N1описывает R. Klopfleisch с соавт. (2007).

В слизистой оболочке, выстилающей носовую полость, отмечено появление гигантских многоядерных клеток, дистрофические изменения обонятельного эпителия, очаги его пролиферации и неравномерной секреции бокаловидных клеток, отек подслизистой оболочки, ее лимфоцитарная инфильтрация и парез сосудов. Все эти признаки характеризовали течение воспалительного процесса.

Отмечалось неравномерное течение патологического процесса с очаговым поражением эпителиальной выстилки трахеи. Дистрофические изменения эпителиоцитов и их десквамация в первые дни заболевания сопровождались нарушениями гемодинамики в виде выраженного отека и диапедезных кровоизлияний. В дальнейшем развивался процесс регенерации эпителия, на фоне которого сохранялись дистрофически-некротические изменения.

Прослеживалось неравномерное поражение респираторной ткани легких. На фоне гнойного бронхита и эмфизематозно расширенных альвеол характерно присутствие очагов воспалительно-клеточной инфильтрации. Одновременно отмечались очаги воспаления с некрозом межальвеолярных перегородок и формированием фокусов некроза.

Наблюдали признаки дистрофии и некроза гепатоцитов, крупные кровоизлияния в паренхиму. Регистрируемые патологические изменения характерны для инфекционно-токсического поражения печени.

Делимфатизация красной пульпы селезенки, в белой – крупные фолликулы с расширенным и некротизированным герминативным центром. Выявленные изменения, отражают выраженную антигенную стимуляцию органа и развитие общесептической реакции.

При исследовании ткани почек установлена дистрофия нефротелия, набухание почечных клубочков, регистрировались кровоизлияния в строме и формирование субкапсулярных кист с геморрагическим содержимым.

При изучении гистологических препаратов тонкого кишечника обнаружено слияние апикальной поверхности ворсинок, формирование крипт-абсцессов на фоне отека и интенсивной воспалительно-клеточной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки, дистрофия и десквамация энтероцитов, интенсивный трансэпителиальный диапедез.

Регистрировали дистрофические изменения и десквамацию каемчатых колоноцитов, интенсивную мононуклеарную инфильтрацию, опустошение лимфоидных образований, формирование крипт-абсцессов, очаги некроза.

В ткани сердца обнаружена дистрофия кардиомиоцитов, мононуклеарная очаговая инфильтрация, диапедезные кровоизлияния. На 5-й день обнаружен крупный очаг некроза миокарда, на 7-й – разволокнение волокон, отек стромы.

В лимфатических узлах зарегистрировано уменьшение количества лимфоидных клеток в корковом и мозговом слоях, делимфатизация лимфоидных фолликулов.



Результаты патолого-гистологического исследования согласуются с данными полученными при проведении аналогичного эксперимента G. F. Rimmelzwaan (2006), а также L. A. Reperant (2008), использовавшего модель на красных лисах.



  1. ВЫВОДЫ

  1. Воспроизведена экспериментальная инфекция гриппа А/H5N1 на представителях вида кошка домашняя путем интраназального заражения вирусом, выделенным из легкого домашнего гуся, погибшего в период эпизоотии гриппа 2005 года, в дозе 500 мкл с титром 10ЭИД50/мл. Инкубационный период составил 8-12 часов, болезнь преимущественно протекала по типу респираторной инфекции. Динамику воспроизводимой инфекции оценивали при убое кошек на 1, 3, 5, 7, 12 и 21-й дни опыта, гибель животных регистрировали на 6, 7, и 8-й день.

  2. Исследованиями носоглоточных смывов подтверждено выделение вируса инфицированными животными во внешнюю среду с 1 по 15-й день эксперимента. Максимальные значения концентрации вируса 104,7   105,0 ЭИД 50/мл зарегистрированы с 5 по 8-й день.

  3. Появление специфических антител в сыворотке крови к вирусу гриппа А/Н5 зарегистрировано на 12-й день (1/40 – 1/1280) и достигли максимальных значений к 21-му дню (>5120) эксперимента, установлена позитивная сероконверсия.

  4. При количественном исследовании вируса в тканях органов и моче вирусологическим и молекулярно-биологическим методом показатели концентрации вируса в легких, трахее, селезенке, головном мозге, почках, сердце и кишечнике достаточно схожи и не превышают 0,3 log10 ЭИД50/мл. Значительные различия установлены при исследовании печени и мочи, титр вируса в печени на 50% больше при исследовании методом культивирования в РКЭ, чем методом ОТ-ПЦР, а в моче на 84,6% больше при исследовании методом ОТ-ПЦР, чем методом культивирования в РКЭ.

  5. Иммуногистохимическим исследованием установлена локализация антигена вируса гриппа А/H5N1 в тканях головного мозга, легких, печени, почек, кишечника и лимфатических узлов, что подтверждает пантропность используемого в эксперименте вируса для кошки домашней.

  6. Первые клинические признаки у кошек, введенных на второй день эксперимента в группу интранозально-инфицированных животных, зарегистрированы через 12 часов, болезнь протекала по типу респираторной инфекции, что свидетельствует о горизонтальной передаче вируса. Гибель данных особей была зафиксирована на 6 и 8-й день эксперимента.

  7. Основные патоморфологические изменения обнаружены в головном мозге, трахее, легких, селезенке, печени, почках, сердце, кишечнике и характеризуются воспалительными процессами, нарушением гемодинамики и морфологическом проявлении ДВС-синдрома.

  1. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Основные практические предложения нашли отражение в методических рекомендациях «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом А/H5N1 в период эпизоотии гриппа птиц» одобренных, рекомендованных к изданию и практическому применению секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 6 от 24 сентября 2009г.) и утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 4 от 10 ноября 2009г.). В рекомендациях изложены краткие сведения о морфологии и биологических свойствах вируса гриппа А/Н5N1, его роли в эпизоотическом/эпидемическом процессе. Определены возможные пути заражения представителей семейства кошачьих вирусом Н5N1-субтипа в период эпизоотии гриппа птиц, описана клиническая и патологоанатомическая картина у представителей данного вида, а также современные методы диагностики.

Полученные данные необходимо учитывать при планировании и проведении противоэпизоотических мероприятий по профилактике и мерам борьбы в случае возникновения гриппа.




  1. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Ковалевская, А.А. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синантропной птицы на территории Омской области / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Ветеринарная патология. – 2007. – № 1 (20). – С. 178-181.

  2. Ковалевская, А.А. Экспериментальная инфекция вируса гриппа A/H5N1 у представителей вида Felis catus / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, А.М. Шестопалов, А.В. Зайковская, И.Г. Дроздов // Ветеринария. – 2010.   № 3. – С. 28-30.

  3. Ковалевская, А.А. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синантропной птицы на территории Омской области в 2006 г. / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Ветеринарный консультант. – 2007.   № 5 (144). – С. 7-10.

  4. Ковалевская, А.А. Изучение патогенности вирусов гриппа A/H5N1 для домашних кошек / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов // Национальные приоритеты России. Актуальные проблемы природной очаговости болезней. – 2009.   № 2. – С. 230-231.

  5. Ковалевская, А.А. Эпизоотия гриппа птиц на территории Омской области в 2006 году / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов // Естественная и специфическая резистентность населения и животных в условиях Сибири: материалы 6-й межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ. – Омск, 2007. – С. 26-29.

  6. Ковалевская, А.А. Грипп птиц в Омской области / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов // Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения: сб. науч. тр. – Омск, 2007. – С. 108-114.

  7. Хатько, Н.Ф. Диагностика и мониторинг гриппа птиц на территории Омской области / Н.Ф. Хатько, А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Молекулярная диагностика – 2007: сб. тр. 6-ой Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. Участием. – Москва, 2007.  – Т. 1.   С. 217-219.

  8. Ковалевская, А.А. Клиническое проявление гриппа A/H5N1 у домашних кошек в эксперименте / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: сб. науч. тр. ведущих ученых России и Зарубежья. – Вып. 3. – Екатеринбург, 2010. – С. 141-144.

  9. Ковалевская, А.А. Результаты титрования вируса гриппа A/H5N1 методом ПЦР в носоглоточных смывах домашних кошек в условиях эксперимента / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: сб. науч. тр. ведущих ученых России и Зарубежья. – Вып. 3. – Екатеринбург, 2010. – С. 144-148.

  10. Малкова, Е.М. Патологические изменения респираторной системы домашних кошек Felis catus при экспериментальном гриппе птиц А (H5N1) / Е.М. Малкова, О.Б. Грицык, А.А. Ковалевская, В.В. Омигов, А.М. Шестопалов, А.В. Зайковская, Е.А. Ставский, И.Г. Дроздов // Морфологические ведомости. – 2010. – № 3. – С. 30-35.




скачать


Смотрите также:
Экспериментальная модель гриппа а/H5N1 на представителях вида кошка домашняя 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 06. 02
262.18kb.
Применение озона в бактериологической диагностике туберкулеза 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
352.56kb.
Фенотипические свойства и эпизоотологическая значимость e. Coli o157: H7 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.94kb.
УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
389.72kb.
Разработка s- и r-бруцеллёзных эритроцитарных диагностикумов, изучение их эффективности при бруцеллезе животных 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
341.63kb.
Разработка новых методов генодиагностики болезни марека и определение их роли в системе противоэпизоотических мероприятий 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
322.73kb.
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
337.59kb.
Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
304.73kb.
Влияние биологически активных веществ на иммунный статус норок при алеутской болезни и иммунодефицитных состояниях 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
285.95kb.
Комплексная сравнительная оценка эпизоотич еской ситуации туберкулеза животных и методов его диагностики в сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
299.94kb.
Эпизоотологический мониторинг гриппа типа а среди диких водоплавающих птиц и птиц околоводного комплекса на территории полуострова Таймыр 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
287.03kb.
Лечебно-профилактическая эффективность витартила и йодантипирина при респираторных болезнях телят вирусно-бактериальной этиологии 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология
312.01kb.